¿Cómo realizar qPCR en dos genes altamente conservados?
En términos generales, MasterMix es una solución concentrada 2X para qPCR en tiempo real, y solo es necesario agregar plantillas y cebadores. Debido a la alta sensibilidad de la qPCR en tiempo real, se requieren al menos 3 pocillos paralelos para cada muestra para evitar que sea posible el análisis estadístico debido a grandes diferencias de Ct o SD demasiado grandes en análisis de datos posteriores. En términos generales, la concentración final de cebadores en el sistema de reacción es de 100 a 400 mM si el molde es ARN total, suele ser de 10 ng a 500, si es ADNc, suele ser 1 ul o una dilución 10 veces de 1 ul; sobre la abundancia de expresión del gen diana Realice ajustes. Por supuesto, estos son valores empíricos. Durante la operación, es necesario realizar la optimización de acuerdo con la MasterMix, la plantilla y los cebadores utilizados para lograr un sistema de reacción óptimo. Durante el proceso de configuración del sistema de reacción, se deben tener en cuenta los siguientes puntos:
1. No congelar ni descongelar MasterMix repetidamente. Si se usa con frecuencia, lo mejor es disolverlo y almacenarlo a 4 grados. .
2. Se preparan más mezclas para reducir los errores de muestreo. Lo mejor es operar sobre hielo.
3. ¡Cada tubo u orificio debe reemplazarse con una punta de tubo nueva! ¡No utilice la misma punta de pipeta para añadir muestras continuamente!
4. Después de añadir todos los ingredientes, centrifugar para eliminar las burbujas de aire.
5. Al menos 3 pocillos paralelos para cada muestra.
Los colorantes de referencia o calibración comúnmente utilizados (colorante de referencia, colorante pasivo) son ROXTM (ahora marca registrada de ABI!) u otros colorantes, siempre y cuando no afecten el valor de fluorescencia de la PCR detectada. producto. La función del tinte de referencia es estandarizar la agitación no PCR en la reacción cuantitativa de fluorescencia, corregir el error de muestreo o el error entre pocillos y proporcionar una línea de base estable. Ahora muchas empresas han formulado ROXTM en MasterMix o Premixture. Si la curva de reacción es buena o el sistema de reacción se ha optimizado, no es necesario agregar colorante ROXTM para la calibración.
En términos generales, el procedimiento de reacción de qPCR en tiempo real no requiere los tres pasos de desnaturalización, hibridación y extensión como la PCR convencional. Dado que la longitud del producto está entre 80 y 150 pb, solo se requieren desnaturalización y recocido. Para métodos de tinte como SYBR@Green, es mejor agregar un proceso de disolución después del proceso de amplificación por PCR para formar una curva de disolución para determinar la amplificación específica del producto de PCR. En cuanto al programa de disolución, los instrumentos tienen configuraciones predeterminadas o son ligeramente diferentes, pero todos recopilan señales de fluorescencia cuando el producto se disuelve.
3. Configuración del instrumento
Las operaciones de todos los instrumentos son básicamente las mismas. La configuración incluye la configuración de la placa y la configuración del programa. Tomemos ABI StepOne como ejemplo para observar la configuración de la reacción en detalle:
A. El primero es elegir el propósito del experimento: cuantitativo u otro. Lo llamamos "BioTeke" y realizamos experimentos "cuantitativos".
B. Selección de métodos experimentales: El método SYBR Green que elegimos para comparar Ct, programa Fast, utiliza ADNc como plantilla.
C. Configuración de los genes diana: Hay varios genes diana y nombres de los genes diana.
D. Configuración de muestra: incluyendo cuál es el grupo experimental y cuál es el grupo de control. Así como configuraciones para controles negativos y réplicas biológicas.
E. Configuración del grupo de control y genes de referencia internos: esto es para preparar la cuantificación posterior.
F. Basado en el MasterMix de diferentes empresas. Por ejemplo, BioTeke puede activar la ADN polimerasa a 95°C durante 2 minutos (ABI requiere 10 minutos). La reacción del ciclo es de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 15 segundos. Simplemente use la configuración predeterminada del instrumento para el programa de curva de disolución. O el procedimiento recomendado en el manual del instrumento.