¿Cuáles son las aplicaciones de los cebadores asimétricos?
El número de solicitud de patente es CN200410056866.0
Fecha de solicitud de patente: 26 de agosto de 2004
Un método de amplificación por PCR asimétrica y sus cebadores dedicados Aplicación
Publicación (Anuncio) No. CN1629305
Fecha de publicación (Anuncio) 22 de junio de 2005
Categoría Química. ; Metalurgia
Fecha de certificación
Prioridad
Solicitud (derecho de patente) Beijing Boao Biochip Co., Ltd.
Dirección : 102206 Parque de Ciencias de la Vida, Distrito de Changping, Carretera No. 18 de Beijing
Inventores (diseñadores) Zhang Zhiwei Wei; Zhu Lingxiang Zhang Qiong
Aplicación internacional; p>
Anuncio internacional
Fecha de entrada
Agente de patentes Beijing Jikai Intellectual Property Agency Co., Ltd.
Agente Guan Chang
Resumen
La presente invención Se divulga un método de amplificación por PCR asimétrica y sus cebadores y aplicaciones especiales, con el objetivo de proporcionar un método de amplificación por PCR que pueda preparar productos de amplificación monocatenarios de manera simple y eficiente. Los cebadores de PCR asimétricos proporcionados por la invención incluyen múltiples pares de cebadores de PCR y se caracterizan porque se añade una cola de oligonucleótido no relacionada con la secuencia diana que se va a amplificar al extremo 5' de un par de cebadores. El método de amplificación por PCR asimétrica proporcionado por la invención incluye los siguientes pasos: 1) predesnaturalización; la primera parte de la amplificación por PCR incluye varios ciclos de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión del cebador; la segunda parte de la amplificación por PCR incluye varios ciclos de desnaturalización y cebador; ciclos de extensión. Se añade una cola de oligonucleótido no relacionada con la secuencia diana que se va a amplificar al extremo 5' de un cebador en el par de cebadores de PCR utilizado para la extensión del cebador. El método de amplificación por PCR asimétrica de la presente invención tiene un alto rendimiento monocatenario, puede realizar una amplificación por PCR única o múltiple y puede usarse ampliamente en la detección de ácidos nucleicos.
Términos soberanos
1. Un cebador de PCR asimétrico, que incluye varios pares de cebadores de PCR, caracterizado por agregar una sección al extremo 5' de un cebador en cada par de cebadores. la cola del oligonucleótido es irrelevante para la secuencia diana que se va a amplificar.
Secuenciación directa de productos de PCR
Purificación en gel de secuencias diana amplificadas por PCR
Si las condiciones óptimas de la reacción de PCR no producen el producto específico deseado, se puede volver a amplificar con nuevos oligonucleótidos, o separar diferentes productos de PCR mediante electroforesis en gel y luego volver a amplificar cada producto de PCR para el análisis de secuencia. Se pueden separar fragmentos de diferentes longitudes mediante electroforesis en gel de agarosa:
1. Cuando el tamaño del fragmento es de 80 a 100 pb, se puede utilizar un gel de agarosa o poliacrilamida ordinario 3NuSieve1 para la separación.
2. Cortar del gel la sección que contiene el fragmento de PCR de Sudáfrica.
3. Agregue 50∽100μl de TE para remojar la película. Puede congelarse repetidamente o dejarse durante varias horas para permitir que el ADN se difunda fuera del gel.
4. Tomar una pequeña cantidad (1-5) para la segunda amplificación. Para obtener un producto único puro, la cantidad de extracto en gel utilizada para la segunda amplificación por PCR debe ser inferior a 65438 ± 0 ng.
5. Se ha descubierto que la agarosa contiene sustancias que inhiben la actividad de la polimerasa Tab. Por lo tanto, si es necesario volver a amplificar el fragmento para la secuenciación de la polimerasa Tab, lo mejor es utilizar electroforesis de acrilamida para la separación.
Cuando se utilizan cebadores de PCR para amplificar varias secuencias relacionadas de la misma longitud, como el mismo cebador de varios genes recién replicados, secuencias repetitivas o secuencias señal conservadas, esto se puede mejorar mediante los dos métodos diferentes siguientes Separación electroforética. 1). Primero use endonucleasa para cortar solo una plantilla y luego use electroforesis para purificar el producto de PCR completo. 2) Sistema de electroforesis para separar productos de amplificación con diferentes secuencias de nucleótidos. En la siguiente sección se analizará la desnaturalización de los sistemas de gel con gradiente de formamida entre dichos sistemas. Por ahora, es necesario conocer de antemano los sitios de endonucleasa en diferentes productos de PCR.
Secuenciación directa de híbridos
Cuando dos alelos difieren debido a una mutación de un solo sitio, el sitio heterocigoto se puede descubrir mediante secuenciación directa con cebadores de PCR. Sin embargo, las plantillas alélicas con varias mutaciones puntuales o fragmentos cortos de inserción/deleción se secuenciarán directamente con un cebador de PCR, lo que generará una escalera de secuenciación compuesta. Para identificar varias jorobas, existen cuatro formas de obtener la secuencia de un solo alelo de un heterocigoto: 1). Clonar y aislar diferentes plantillas; 2) Antes de la secuenciación, utilice la diferencia en las secuencias de nucleótidos entre las plantillas para separar diferentes plantillas mediante tecnología de electroforesis; 3) Solo se activa un alelo en la reacción de secuenciación;
Preparación de plantillas de secuenciación
Algunos problemas asociados con la secuenciación directa de productos de PCR son que después de la desnaturalización, las dos cadenas del fragmento amplificado pueden combinarse rápidamente, impidiendo así que el cebador de secuenciación se secuencia complementaria Hibrida o previene la extensión del complejo cebador-molde. Durante la reacción de secuenciación, la recombinación de la cadena plantilla hace que una pequeña porción del módulo se analice para la secuenciación, debilitando así la banda de secuenciación final. Para reducir este problema, se pueden preparar plantillas monocatenarias mediante secuenciación de ADN bicatenario estándar modificado o PCR.
Plantillas de ADN de doble cadena
Existen dos métodos diferentes para preparar plantillas para secuenciación, y ambos métodos se han utilizado para determinar bucles cerrados con valencias de * * * Secuencia de ADN de doble cadena. Plantilla de plásmido trenzado. A menudo resulta difícil secuenciar productos de PCR con estos métodos porque las plantillas lineales cortas son más fáciles de recombinar que los plásmidos bicatenarios. En ambos métodos, los fragmentos de PCR se pueden purificar mediante electroforesis en gel o diálisis por rotación antes de la electroforesis.
1. Desnaturalizar la plantilla en NaOH 0,2 M durante 5 min a temperatura ambiente, congelar y añadir 0,4 veces de acetato de amonio 5 M (pH 7,5) para neutralizar la reacción. Precipitar inmediatamente el ADN con cuatro volúmenes de etanol absoluto. Agregue cebadores de tampón de secuenciación a la temperatura de recocido adecuada.
2. Mantenga la temperatura a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar la plantilla y enfríe rápidamente el tubo de centrífuga en un baño de hielo (o etanol con hielo seco) para reducir la reorganización de la cadena. Agregue cebadores de secuenciación y permita que la reacción alcance la temperatura adecuada. Los cebadores de secuenciación se pueden agregar antes o después de la desnaturalización.
Plantilla de ADN monocatenario
El uso de plantillas monocatenarias puede evitar la recombinación de cadenas durante la secuenciación. Las plantillas monocatenarias se pueden preparar a partir de plantillas de ADN bicatenario mediante geles de separación de cadenas o reacciones de PCR.
Los fragmentos de ADN monocatenario de más de 500 pb se pueden separar de los geles de agarosa, pero las cadenas sencillas más cortas no son adecuadas. Una forma diferente de preparar ADN monocatenario es utilizar cebadores marcados con biotina en una reacción de PCR. El producto desnaturalizado de la PCR se pasa a través de una columna de avidina para separar las dos cadenas, y sólo la cadena marcada con biotina puede unirse a la columna. Sin embargo, el método más sencillo es utilizar un método de PCR modificado para preparar ADN monocatenario establecido. En esta reacción (PCR asimétrica), en los primeros 20-25 ciclos, dos cebadores de amplificación en una proporción asimétrica producen ADN bicatenario, y cuando los cebadores limitantes se agotan, los siguientes 5-10 ciclos generan ssDNA. Después de unos 25 ciclos, comienza a aparecer ADN monocatenario y el número limitado de cebadores está casi agotado. Después de un aumento breve y rápido, el ssDNA comenzó a acumularse linealmente como se esperaba cuando solo estaba presente un cebador en la reacción. Diferentes proporciones de cebadores producen esta forma de ssDNA. En términos generales, para un sistema de reacción de PCR de 100 l, la proporción de cebador es 50 pmo:0,5 pmol, y se pueden producir aproximadamente 1-3 pmol de ADN ss después de 30 ciclos. El rendimiento de ssDNA se puede estimar mediante: a). En la reacción de PCR, además de la cantidad normal de ADNd, también se añaden 32P-dNTP. Los productos de reacción de 10 se sometieron a electroforesis en un gel fino de agarosa simple 3 NuSieve 1, se secaron y se expusieron junto con la película. b). Se gelificaron 5 reactivos, se transfirieron a la membrana y se hibridaron usando oligonucleótidos complementarios al ADNss como sondas. El ADNss no se puede cuantificar mediante tinción con EB porque el ADNss tiende a formar estructuras secundarias y la inserción del tinte en la plantilla es aleatoria. La eficacia de amplificación de la relación de cebadores asimétricos es menor que la del exceso (70)80-90 de los dos cebadores. En los experimentos, esto se puede compensar aumentando el número de ciclos de PCR. Si la reacción de PCR asimétrica no produce suficiente ADNss, podemos probar diferentes proporciones de cebadores. b) Agregar 5-10 ciclos de PCR más c) Agregar más polimerasa Tab (2U) en los últimos cinco ciclos; Pruebe proporciones de cebador asimétricas opuestas. A veces, proporciones opuestas de cebadores asimétricos pueden producir diferentes rendimientos de ssDNA. Secuenciar el ADN monocatenario preparado utilizando un número limitado de cebadores de PCR o cebadores internos, y realizar la secuenciación de incorporación o la secuenciación de cebadores marcados mediante métodos convencionales. La cadena de ssDNA preparada puede tener un extremo 5' discontinuo, pero puede cortarse en diferentes sitios cerca del extremo 3' debido a una terminación prematura durante el proceso de extensión. Sin embargo, para cualquier cebador utilizado en la reacción de secuenciación, solo se puede utilizar ADN ss intacto como plantilla de secuenciación.
Recientemente, se ha informado sobre otro método para preparar plantillas de ácido nucleico monocatenario para secuenciación directa. El método implica agregar un promotor de fago a los cebadores de la PCR, transcribir una copia de ARN del producto de la PCR y luego usar la transcriptasa inversa sin secuenciación. Sin embargo, la aplicación de este método está muy limitada debido a la adición de un paso de reacción enzimática después de la reacción de amplificación y la limitación del uso de transcriptasa inversa como enzima de secuenciación.
Plantillas de ADN de doble cadena
Existen dos métodos diferentes para preparar plantillas para secuenciación, y ambos métodos se han utilizado para determinar bucles cerrados con valencias de * * * Secuencia de ADN de doble cadena. Plantilla de plásmido trenzado. A menudo resulta difícil secuenciar productos de PCR con estos métodos porque las plantillas lineales cortas son más fáciles de recombinar que los plásmidos bicatenarios. En ambos métodos, los fragmentos de PCR se pueden purificar mediante electroforesis en gel o diálisis por rotación antes de la electroforesis.
1. Desnaturalizar la plantilla en NaOH 0,2 M durante 5 min a temperatura ambiente, congelar y añadir 0,4 veces de acetato de amonio 5 M (pH 7,5) para neutralizar la reacción. Precipitar inmediatamente el ADN con cuatro volúmenes de etanol absoluto. Agregue cebadores de tampón de secuenciación a la temperatura de recocido adecuada.
2. Mantenga la temperatura a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar la plantilla y enfríe rápidamente el tubo de centrífuga en un baño de hielo (o etanol con hielo seco) para reducir la reorganización de la cadena. Agregue cebadores de secuenciación y permita que la reacción alcance la temperatura adecuada. Los cebadores de secuenciación se pueden agregar antes o después de la desnaturalización.
Plantilla de ADN monocatenario
El uso de plantillas monocatenarias puede evitar la recombinación de cadenas durante la secuenciación. Las plantillas monocatenarias se pueden preparar a partir de plantillas de ADN bicatenario mediante geles de separación de cadenas o reacciones de PCR. Los fragmentos de ADN monocatenario de más de 500 pb se pueden separar de los geles de agarosa, pero las cadenas sencillas más cortas no son adecuadas. Una forma diferente de preparar ADN monocatenario es utilizar cebadores marcados con biotina en una reacción de PCR. El producto desnaturalizado de la PCR se pasa a través de una columna de avidina para separar las dos cadenas, y sólo la cadena marcada con biotina puede unirse a la columna. Sin embargo, el método más sencillo es utilizar un método de PCR modificado para preparar ADN monocatenario establecido. En esta reacción (PCR asimétrica), en los primeros 20-25 ciclos, dos cebadores de amplificación en una proporción asimétrica producen ADN bicatenario, y cuando los cebadores limitantes se agotan, los siguientes 5-10 ciclos generan ssDNA. Después de unos 25 ciclos, comienza a aparecer ADN monocatenario y el número limitado de cebadores está casi agotado. Después de un aumento breve y rápido, el ssDNA comenzó a acumularse linealmente como se esperaba cuando solo estaba presente un cebador en la reacción. Diferentes proporciones de cebadores producen esta forma de ssDNA. En términos generales, para un sistema de reacción de PCR de 100 l, la proporción de cebador es 50 pmo:0,5 pmol, y se pueden producir aproximadamente 1-3 pmol de ADN ss después de 30 ciclos. El rendimiento de ssDNA se puede estimar mediante: a). En la reacción de PCR, además de la cantidad normal de ADNd, también se añaden 32P-dNTP. Los productos de reacción de 10 se sometieron a electroforesis en un gel fino de agarosa simple 3 NuSieve 1, se secaron y se expusieron junto con la película. b). Se gelificaron 5 reactivos, se transfirieron a la membrana y se hibridaron usando oligonucleótidos complementarios al ADNss como sondas. El ADNss no se puede cuantificar mediante tinción con EB porque el ADNss tiende a formar estructuras secundarias y la inserción del tinte en la plantilla es aleatoria. La eficacia de amplificación de la relación de cebadores asimétricos es menor que la del exceso (70)80-90 de los dos cebadores. En los experimentos, esto se puede compensar aumentando el número de ciclos de PCR. Si la reacción de PCR asimétrica no produce suficiente ADNss, podemos probar diferentes proporciones de cebadores. b) Agregar 5-10 ciclos de PCR más c) Agregar más polimerasa Tab (2U) en los últimos cinco ciclos; Pruebe proporciones de cebador asimétricas opuestas. A veces, proporciones opuestas de cebadores asimétricos pueden producir diferentes rendimientos de ssDNA. Secuenciar el ADN monocatenario preparado utilizando un número limitado de cebadores de PCR o cebadores internos, y realizar la secuenciación de incorporación o la secuenciación de cebadores marcados mediante métodos convencionales. La cadena de ssDNA preparada puede tener un extremo 5' discontinuo, pero puede cortarse en diferentes sitios cerca del extremo 3' debido a una terminación prematura durante el proceso de extensión. Sin embargo, para cualquier cebador utilizado en la reacción de secuenciación, solo se puede utilizar ADN ss intacto como plantilla de secuenciación.
Recientemente, se ha informado sobre otro método para preparar plantillas de ácido nucleico monocatenario para secuenciación directa. El método implica agregar un promotor de fago a los cebadores de la PCR, transcribir una copia de ARN del producto de la PCR y luego usar la transcriptasa inversa sin secuenciación. Sin embargo, la aplicación de este método está muy limitada debido a la adición de un paso de reacción enzimática después de la reacción de amplificación y la limitación del uso de transcriptasa inversa como enzima de secuenciación.