Cómo detectar anticuerpos (ácido nucleico, antígeno, detección de anticuerpos)
¿Qué es un test de antígenos? ¿En qué se diferencia de otros métodos de detección? En este artículo, tomando como ejemplo el nuevo coronavirus, hablaremos sobre los métodos comunes de detección rápida y sobre los principios relacionados y el ámbito de aplicación.
Cuando realizamos un cribado, podemos encontrar la enfermedad o sustancia que queremos detectar. Lo primero que debemos resolver es la cuestión de "por dónde empezar", y la segunda es "cómo detectar", para que los cambios en el mundo microscópico puedan reflejarse en nuestros ojos y ayudarnos a emitir juicios.
¿Por dónde empezar? Estamos ante un virus. Según los conocimientos adquiridos en las clases de biología de la escuela secundaria, los virus son organismos realistas compuestos de material genético y capas de proteínas. Si desea detectar una infección viral, debe comenzar con sus componentes. Espero que utilice sus conocimientos de biología de la escuela secundaria para leer el siguiente contenido.
Tomemos como ejemplo el nuevo coronavirus que nos azota actualmente. Pertenece a la familia de los coronavirus, el coronavirus B, y es el séptimo coronavirus que se sabe que infecta a los humanos. Todos los coronavirus son virus de ARN monocatenario envueltos, es decir, su material genético es una única hebra de ARN. Esta hebra de ARN puede participar directamente en la traducción como ARNm (ARN mensajero) y guiar la síntesis de proteínas.
La especie de virus numerada NPRC 2020.00002 es proporcionada por el Banco Nacional de Recursos de Microorganismos Patógenos (Instituto de Prevención y Control de Enfermedades Virales, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades).
Nuestro objetivo actual es detectar la presencia de este virus en la muestra, ya sea detectando el virus en sí o los productos que trae el virus, hay dos direcciones para comenzar: cubierta de proteína (sobre). y material genético.
La forma más obvia de probar esta lógica es comprobar si se puede ver, pero el virus en sí es muy pequeño y el diámetro del nuevo coronavirus es de 80-120 nm. No es realista escanear cada muestra con un microscopio electrónico y los recursos humanos, materiales y financieros no lo permiten. Entonces, un método más económico y práctico es tomar algunas medidas para permitir que los componentes del virus o algunas sustancias especiales que aparecen debido al virus se acumulen hasta un cierto orden de magnitud y luego brillen, cambien de color y aparezcan macroscópicamente.
Nuestra pregunta entonces es elegir un método que pueda observar cambios a macroescala relacionados con la composición del virus y algo causado por el virus. Los materiales que tenemos a nuestra disposición también están sobre la mesa: el material genético del virus, en este caso su ARN; la envoltura del virus, que es la cubierta proteica y, si recordamos algo de biología básica, el sistema inmunológico del cuerpo responde a la infección por un virus; Posteriormente, se producirán anticuerpos para resistir la invasión, lo que también es una buena opción.
Varios métodos de detección que utilizamos actualmente se derivan de estas sustancias (y sustancias relacionadas), a saber, la detección de ácidos nucleicos para material genético, la detección de antígenos para envolturas y la detección de anticuerpos séricos para anticuerpos.
La prueba de ácido nucleico, como material genético del virus, contiene características genéticas que pueden identificar el virus como una especie específica, por lo que la prueba de ácido nucleico es positiva, lo que indica que el virus ya existe en el cuerpo.
Nuestras "pruebas de ácido nucleico" actuales en realidad se dividen en dos partes. La primera parte es el muestreo de "golpe en la nariz" y "puñalada en la garganta" y el posterior análisis cualitativo. Una vez obtenida la muestra, debido a que la cantidad de virus es demasiado pequeña, la muestra se amplificará en un cierto múltiplo en el laboratorio y se determinará positivo o negativo en función de los resultados de la reacción de fluorescencia.
La segunda parte requiere la secuenciación genética para determinar el tipo de virus de la muestra y así rastrear el origen. Este paso ya no entra dentro del ámbito de la detección sistemática, pero tiene una gran importancia en las investigaciones epidemiológicas. Si está interesado, puede consultar Wikipedia para obtener una breve introducción.
Normalmente nos dedicamos a las pruebas de ácido nucleico como herramienta de detección, refiriéndose a la primera parte de la colección cualitativa.
Después de la infección por el nuevo coronavirus, el ácido nucleico viral se puede encontrar en hisopos de garganta, esputo, secreciones del tracto respiratorio inferior, sangre y otras muestras. La tasa positiva de detección de ácido nucleico en diferentes partes de la muestra es diferente y la tasa de detección de cada parte cambiará con la progresión de la enfermedad.
Lo que estamos acostumbrados a llamar "hisopos nasales" y "hisopos de garganta" en realidad son recogidas de secreciones y tejidos de la pared posterior de la cavidad faríngea. El primero toma muestras de la nasofaringe y el segundo, de la orofaringe. También se pueden utilizar otros estándares, como la saliva, como muestras de prueba, y existen diferencias esenciales en las diferentes regiones.
Tanto los hisopos nasales (de garganta) como los hisopos orales (de garganta) tienen en cuenta la tasa positiva y la conveniencia. De hecho, las heces y la orina también pueden utilizarse como objetos de recogida de muestras. Y según un estudio de 31 pacientes, la precisión de los hisopos anales es mayor que la del muestreo nasofaríngeo y orofaríngeo, especialmente en las últimas etapas de la enfermedad. Entre los casos confirmados mediante hisopos anales, la tasa positiva de hisopos nasales es inferior a 30. %. Sin embargo, obviamente debido a limitaciones operativas, no puede utilizarse como primera opción para la detección temprana.
El siguiente paso es extraer los ácidos nucleicos de la pequeña muestra obtenida. Debido a que la cantidad de virus en la muestra es demasiado pequeña para analizarla, se requiere amplificación y etiquetado.
Lo que se debe utilizar también es el conocimiento aprendido en la escuela secundaria: reacción en cadena de la polimerasa (PCR): este paso parece problemático, pero debido a que los principios y procesos se han aprendido bien, en la operación real, solo necesita agregar reactivos y enviarlos. a la máquina. Simplemente continúa. La parte más problemática de todo el proceso de prueba de ácido nucleico es permitir que los sujetos obtengan las muestras de forma segura (risas).
Las agencias locales de control de enfermedades o centros de pruebas comprarán kits de extracción de ácido nucleico y kits de detección de ácido nucleico adecuados. El kit de extracción se encarga de extraer el ARN de muestras mixtas (restos celulares, secreciones, polvo y otras impurezas). Los métodos comunes incluyen el método de perlas magnéticas, el método de columna giratoria y el método de agente liberador. Los diferentes métodos de extracción pueden tener un ligero impacto en la precisión de la detección posterior. Posteriormente, el ARN purificado se entregará al kit de detección (algunos kits combinan ambos) para su posterior procesamiento.
El proceso del kit de prueba que lleva la muestra a la máquina es la reacción más importante de esta prueba: RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real).
A continuación, necesito que recojas tus conocimientos de biología de la escuela secundaria. Una reacción de PCR general consta de los siguientes pasos:
Calentamiento: el ADN bicatenario se desenrosca y se deforma en dos hebras simples. Hibridación: el ADN monocatenario mezclado se combina con cebadores diseñados según el fragmento a tratar; ser copiado; extensión: Ajuste la temperatura para permitir que la ADN polimerasa comience a trabajar a lo largo del cebador, copiando una nueva hebra para formar una nueva doble hebra. A la hora de detectar virus, todo lo que tenemos que hacer son los pasos anteriores, pero también necesitamos dos cosas:
Antes de la primera reacción, utilizar la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN) para sintetizar el virus. Las hebras complementarias. de ARN monocatenario se combinan para formar ADNc. Durante las etapas de recocido y extensión, se requieren sondas TaqMan además de los cebadores y las enzimas necesarias. Puede entender la sonda TaqMan de esta manera: su parte principal es una cadena de oligonucleótidos, diseñada para emparejarse con una pequeña cantidad de fragmentos de genes que deben copiarse para formar una doble cadena, un extremo está conectado a una molécula fluorescente; el otro extremo está conectado a un interruptor (grupo de extinción). Cuando los dos están conectados a la sonda, el grupo de extinción inhibirá la fluorescencia y no podrá detectarse. Durante el proceso de hibridación, la sonda se unirá al fragmento monocatenario que se replicará con el cebador. Durante el proceso de extensión, la ADN polimerasa cortará los obstáculos que tiene delante, incluida esta sonda. De esta manera se separa el grupo extintor y la molécula fluorescente y se muestra la fluorescencia.
A medida que aumenta el número de ciclos, se amplifican cada vez más fragmentos de ADN y fluorescencia. Al comparar el brillo de la fluorescencia de cada ciclo con el brillo de referencia de los ciclos anteriores, se puede obtener la cantidad actual de fragmentos de ADN o se puede utilizar directamente el número de ciclo y el brillo de la fluorescencia para realizar un juicio cualitativo.
Entonces, ¿qué parte debería copiarse específicamente? Como desea detectar el virus, elija el fragmento de ácido nucleico más representativo. En los estándares actuales, los genes ORF y los genes N son sitios de detección comúnmente utilizados.
El kit de detección se encarga de colocar el ARN extraído (muestra), configurar la temperatura y duración de la PCR correspondiente según las instrucciones del programa del kit, completar el proceso de amplificación bajo control de la máquina y recolectar a temperatura fija. vincula la señal de fluorescencia y registra el número de ciclo correspondiente (valor Ct). El criterio para juzgar negativo-positivo/infeccioso es el número de ciclo actual cuando la señal de fluorescencia alcanza el umbral. Según el actual "Plan de tratamiento y diagnóstico del nuevo coronavirus (novena edición de prueba)", el estándar para levantar la gestión del aislamiento es un valor Ct ≥ 35. En comparación con el estándar anterior de ≥40, el tiempo de aislamiento de descarga se reducirá considerablemente.
La prueba de ácidos nucleicos mediante RT-PCR es ahora el estándar de oro para el diagnóstico porque puede alcanzar una precisión del 100% desde un punto de vista metodológico. Sin embargo, las pruebas de ácido nucleico llevan mucho tiempo y plantean grandes exigencias al medio ambiente y a los operadores. Cuando las condiciones ambientales no cumplen con los estándares y los materiales e instrumentos no están completos, una gran cantidad de pruebas de ácido nucleico provocarán un enorme consumo de recursos humanos y financieros.
En esta epidemia, los métodos de detección inmune que utilizamos incluyen la detección rápida de antígenos y la detección de anticuerpos. Basado en la reacción antígeno-anticuerpo, mediante la neutralización rápida de antígenos y anticuerpos, la detección se puede realizar en menos tiempo y. costo.La presencia del analito en la muestra. Ambos pertenecen a la categoría de inmunocromatografía.
El test de antígenos viene en una caja y puede ser operado por uno mismo, lo que resulta muy adecuado como complemento cuando los materiales son insuficientes y la decisión la toma uno mismo.
La detección de antígenos y la detección de ácidos nucleicos examinan el material genético del virus, que es el "interior" del virus. Luego, la prueba (rápida) de antígenos examina la “apariencia” del virus, examinando directamente las partículas intactas del virus. Actualmente existen tres kits de detección de antígenos aprobados: método de oro coloidal, método de látex y método de inmunocromatografía de fluorescencia. Los principios internos de los tres son consistentes. Sin embargo, el kit de inmunocromatografía de fluorescencia todavía requiere un detector especializado o una linterna UV y no es adecuado para la autoevaluación casera. Tanto el método del oro coloidal como el método del látex convierten los resultados de la prueba en bandas visibles, y la diferencia radica en el etiquetado y el color; Los métodos Los materiales son diferentes.
Por supuesto, las pruebas de antígenos naturalmente tienen sus desventajas, es decir, su tasa de falsos negativos (positivos pero negativos) es alta, lo que puede llevar a detecciones omitidas y detecciones falsas. Pero ante la ventaja de tiempo que supone obtener resultados en una taza de té, la brecha de precisión puede verse comprometida temporalmente en algunos casos.
Fuente: ASM.org Cómo funciona la prueba de antígeno EUA del nuevo coronavirus
En comparación con las pruebas de ácido nucleico, las pruebas de antígeno aumentan el método de muestreo de "hisopo nasal" y reduce el costo personal. Dificultad de autoevaluación.
La muestra del hisopo de algodón se eluye en el tampón y el líquido se gotea en el orificio de muestreo. El líquido pasará a través del área del anticuerpo (almohadilla de unión) precargada con antígenos potenciales debido a la acción capilar.
Los anticuerpos de esta región son anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno diana (nuevo coronavirus). Cada molécula de anticuerpo está unida a una etiqueta especial y reacciona con el antígeno de la muestra para formar un complejo antígeno-anticuerpo que fluye a la siguiente tira reactiva mediante acción capilar.
Luego está la línea de prueba (línea T), a la que también se unen anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno diana. Puedes entender que las cosas aquí son las mismas que en las almohadillas, solo que no están etiquetadas. En este momento, si el sujeto ha sido infectado con el nuevo coronavirus, el complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno que dejó en la muestra se combinará aquí nuevamente con los anticuerpos fijados en la línea. Aquí, los compuestos marcados se depositan y eventualmente aparecen como una banda oscura o clara. La fuente de color del papel de prueba es la etiqueta adherida a la molécula de anticuerpo en la almohadilla de unión anterior. El método de oro coloidal son partículas de oro coloidal, el método de látex son gotas de látex coloreadas y el método de fluorescencia son moléculas fluorescentes. Entonces, cuando utilice este tipo de papel de prueba, encontrará que cuando se acaba de agregar la muestra y el líquido comienza a esparcirse, habrá un color ligeramente brillante en el extremo frontal de la difusión. Este es el color de la marca. Aún no se ha asentado ni asentado.
A continuación, el líquido continúa extendiéndose y pasa a través de la línea de control (línea C). Otro anticuerpo, el "anticuerpo monoclonal anti-antígeno objetivo", se une a la línea de control, denominado "anticuerpo secundario". . Este nuevo anticuerpo se obtiene reaccionando con el último anticuerpo del sistema inmunológico de otro animal. Por ejemplo, el anticuerpo que se une a la almohadilla proviene del conejo. El anticuerpo aquí proviene de la oveja y es un anticuerpo monoclonal contra el conejo. En otras palabras, el antígeno del anticuerpo secundario es el anticuerpo de la plataforma de unión anterior. Esta línea existe para detectar si el líquido se está propagando normalmente, si los anticuerpos en la almohadilla de unión han fallado, etc. En este momento, una gran cantidad de anticuerpos que quedan en el líquido de la almohadilla de unión actuarán como antígenos y reaccionarán con el segundo anticuerpo en la línea de control de calidad para formar un complejo que muestra una banda obvia.
Debido a que los anticuerpos en la almohadilla de unión son relativamente abundantes, esta línea de control de calidad aparecerá y desarrollará color rápidamente. Sin embargo, dado que la cantidad de antígenos (virus) no es segura, la velocidad de desarrollo del color de la línea de detección variará, pero generalmente 15 minutos son suficientes para determinar el resultado. Así que no mires las radiografías. Aparentemente, los rayos T se sienten vagamente como "nada". No importa qué tan profundo sea el rayo T, mientras exista, es positivo.
Para operaciones específicas, consulte el vídeo instructivo publicado por la Administración Médica y la Autoridad Hospitalaria. En la actualidad, el país está promoviendo gradualmente kits de autoprueba de antígenos, que pueden aliviar en cierta medida la presión sobre la atención médica y de calle en el futuro.
Además de los dos primeros métodos de detección, existe otro método de detección igualmente importante pero menos utilizado, que es la “detección de anticuerpos séricos”, que pertenece al mismo método de detección inmune.
El kit para la detección de anticuerpos está muy cerca de la detección de antígenos, pero la muestra es más limitada: debido a que el objeto de prueba se ha convertido en un anticuerpo, la muestra debe ser sangre (o plasma, etc.) con un color claro. anticuerpos. Además, el cuerpo humano no producirá anticuerpos inmediatamente después de ser infectado con el virus por primera vez. Los anticuerpos alcanzan definitivamente niveles detectables, generalmente una o dos semanas después de la primera infección (o vacunación). Estas condiciones limitan el uso de pruebas de anticuerpos como pruebas de diagnóstico. Actualmente, las pruebas de anticuerpos séricos sólo se utilizan como forma de comprobar si una vacuna es eficaz en una situación específica o si el sujeto ha sido infectado recientemente con COVID-19.
Existen cinco tipos de anticuerpos en el cuerpo humano: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. La IgA es la principal responsable de la inmunidad de las mucosas. La IgD está asociada con la activación de respuestas inmunes. La IgE protege contra los parásitos y también participa en reacciones alérgicas. Las IgG e IgM restantes son las principales fuerzas enviadas por el sistema inmunológico en el proceso de lucha contra los patógenos.
Como patógeno, el nuevo coronavirus es secretado principalmente por el cuerpo humano después de ser estimulado. Los kits de detección de anticuerpos existentes se dirigen principalmente a las IgG e IgM producidas por el cuerpo humano contra la proteína N (proteína de la nucleocápside) o la proteína S (proteína de pico) del nuevo coronavirus.
El aspecto del dispositivo de detección del kit de anticuerpos es el mismo que el de la detección de antígenos. La diferencia entre los dos radica en las sustancias adheridas a las almohadillas, líneas de detección y líneas de control de calidad mencionadas anteriormente.
Esta vez, la muestra caída en el orificio de muestreo puede contener nuevos anticuerpos contra el coronavirus. Por lo tanto, la almohadilla de unión debería ser el antígeno marcado; por supuesto, no hay posibilidad de liberar el virus. Generalmente, las proteínas antigénicas aquí utilizadas han sido diseñadas y probadas, como la proteína N o la proteína S mencionadas anteriormente, o virus recombinantes. Sea lo que sea, debe contener un dominio de unión al receptor (RBD) como objetivo para que se una el anticuerpo. En la línea de detección, se unen anticuerpos anti-IgM o anti-IgG para capturar las proteínas del anticuerpo que se unen al antígeno. Finalmente, se conectan anticuerpos específicos de antígeno a la línea de control para capturar el antígeno libre restante.
Resumen: En general, los tres métodos de detección satisfacen diferentes necesidades, cada uno tiene sus propias ventajas y se complementan entre sí. La prueba de ácido nucleico, como estándar de oro, verifica directamente el ARN del virus y es responsable de ver si el paciente tiene el virus; la prueba de antígeno, como método de detección rápida, verifica la proteína del virus, pero su precisión no es tan precisa. precisa como la prueba de ácido nucleico y es más eficaz para infecciones altamente contagiosas. Las pruebas de anticuerpos comprueban si la vacuna ha hecho efecto y si alguien ha sido infectado recientemente con el virus.
Recientemente, la epidemia de neumonía por el nuevo coronavirus ha regresado a varios lugares.
En comparación con la variante Delta que circulaba anteriormente, la variante Omicron tiene un período de incubación más corto, una replicación viral más rápida y una infectividad significativamente mayor, aunque las tasas de mortalidad y gravedad se reducen significativamente. Espero que todos se mantengan saludables en este entorno.