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¿Qué factores afectarán a la expresión de genes diana en E. coli?
Respuestas recomendadas (1) Número de copias de genes extraños
(2) Eficiencia de expresión de genes extraños
①Fuerza del promotor
Eficaz ②El género del sitio de unión del ribosoma
③La distancia entre la secuencia SD y el codón de inicio ATG
④Codón
⑶Expresa la estabilidad del producto.
(4) Carga metabólica celular
⑸Condiciones de cultivo de bacterias de ingeniería
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Establecer un vector y un gen diana en Raíces de plantas y secreción de expresión extracelular de raíces. Indique el número de pasos: 842 Puntos de bonificación: 20 | Resuelva el problema.
Hora: 14 de febrero de 2009 09:13 | Interlocutor: 370 629 225
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El objetivo final de la transformación genética vegetal no es establecer un vector de expresión vegetal de un gen extraño específico y transferirlo a la planta receptora. La planta transgénica ideal generalmente requiere altos niveles de expresión de genes exógenos en un lugar específico y en un momento específico para el cual se esperan rasgos fenotípicos. Sin embargo, en el proceso de desarrollo de las últimas dos décadas, la eficiencia de la expresión es a menudo baja, los productos de expresión son inestables e incluso los genes están inactivados o silenciados, lo que hace imposible poner en aplicación práctica los genes extraños de las plantas transgénicas. en plantas receptoras. Además, la seguridad de las plantas genéticamente modificadas ha generado preocupación en muchos países, como la transmisión del polen de las plantas genéticamente modificadas, y los genes marcadores de selección de antibióticos pueden hacer que algunos antibióticos sean clínicamente inútiles. El surgimiento de esta ingeniería genética vegetal de alta tecnología está plagando los problemas mencionados en un momento sin precedentes. Para resolver estos problemas, la gente ha estado cultivando tecnología transgénica en los últimos años, y la exploración y mejora, mejora y optimización de una amplia gama de vectores de expresión de plantas es uno de los contenidos más importantes. Se revisa el avance de la investigación de este artículo.
La selección y transformación de 1 promotor para niveles de expresión de genes exógenos son a menudo razones importantes para que las plantas transgénicas no sean satisfactorias. Los promotores juegan un papel clave en la expresión genética. Por tanto, seleccionar un promotor vegetal adecuado para mejorar su actividad es la primera cuestión a considerar a la hora de mejorar la expresión de genes exógenos.
En este vector de expresión vegetal, los promotores ampliamente utilizados son promotores constitutivos, por ejemplo, el promotor CaMV35S utilizado por la mayoría de las dicotiledóneas, el promotor de ubiquitina utilizado por las monocotiledóneas y el promotor Actinl utilizado en el arroz. El gen extraño está bajo el control de un promotor y se expresa en estos elementos en todas las partes de la planta transgénica y en todas las etapas de desarrollo. Sin embargo, la expresión de genes extraños en las plantas receptoras es continuamente eficaz, lo que no sólo provoca residuos, sino que a menudo también provoca cambios morfológicos en las plantas y afecta al crecimiento y desarrollo de las plantas. Para ejercer eficazmente los efectos de las plantas y reducir los efectos adversos de las plantas, la investigación y aplicación de genes exógenos con promotores de expresión específicos han atraído cada vez más atención. Se ha descubierto que promotores específicos, incluidos promotores específicos de órganos, inducen promotores específicos. Por ejemplo, promotores específicos de semillas, promotores específicos de frutas, promotores específicos de células del mesófilo, promotores específicos de raíces que se destruyen, promotores específicos inducidos químicamente, promotores específicos inducidos por luz, promotores específicos inducidos por choque térmico, etc. La clonación de promotores específicos sienta las bases para la expresión de genes extraños en plantas. Por ejemplo, el promotor suizo CIBA-Gage PR-IA controla la expresión de los genes de la toxina Bt en el tabaco transgénico. El promotor ácido salicílico y sus derivados inducen la fumigación con alcohol, que es barato y no contamina, e induce plagas con expresión genética resistente durante el proceso. esta temporada. Una vez más, obviamente es un método muy efectivo.
En la investigación de plantas transgénicas, a menudo no se obtienen resultados satisfactorios, especialmente en el uso de promotores naturales para la expresión específica y la expresión inducida, y los niveles de expresión son en su mayoría insatisfactorios. Transformar los promotores existentes y construir promotores compuestos será un enfoque muy importante. Por ejemplo, la región de activación de la transcripción de Ni es el promotor del gen de la octopina sintasa y del gen de la manolina sintasa. Los resultados de la expresión de GUS mostraron que la actividad del promotor modificado era significativamente mayor que la del promotor 35S. Wu Rui et al. aumentaron la actividad del promotor recién expresado casi 10 veces manipulando la combinación del intrón Actinl de arroz del promotor del gen PI-II inducible (patente). En la investigación de la ingeniería genética vegetal, el inicio de estas síntesis artificiales juega un papel importante.
La construcción de vectores para mejorar la eficiencia de traducción de genes extraños, generalmente modificación genética, considera principalmente tres aspectos:
2.1 Mejora de la eficiencia de traducción de secuencias 5'-3' no traducidas
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Muchos experimentos han encontrado que la expresión normal de la secuencia no traducida (UTR) 5'-3' de genes eucarióticos es muy necesaria, y la estabilidad y el nivel de traducción del ARNm en esta región son a menudo se reduce significativamente. Por ejemplo, la cadena arriba del sitio de inicio de la traducción del gen proteico de 126 kda del virus del mosaico del tabaco (TMV) consta de un elemento omega de nucleótidos de 68 pb, que proporciona un nuevo sitio de unión al ribosoma y aumenta la actividad de traducción del gen Gus en docenas. de tiempos. Hay muchos vectores con secuencias potenciadoras de la traducción omega en el extremo 5' del gen extraño.
Ingelbrecht describió las secuencias terminales 3' de varios genes que habían sido estudiados y descubrió que la secuencia terminal 3' del gen de la octopina sintasa aumentaba la expresión transitoria del gen NPTII en más de 20 veces. Además, la eficiencia de mejora de la expresión genética de diferentes genes es diferente en la promoción de la expresión genética. Por ejemplo, la secuencia terminal 3' de los glóbulos rojos es más de 60 veces mayor que la del gen de la chalcona sintasa terminal 3'.
2.2 Optimizar la secuencia alrededor del codón de inicio
Aunque los codones de inicio son comunes en la biosfera, genes de diferentes orígenes biológicos tienen su propia subsecuencia especial de codones de inicio externos. Por ejemplo, la secuencia alrededor del codón de inicio de la planta es típicamente AACCAUGC, y la secuencia alrededor del codón de inicio del animal, CACCAUG, es muy diferente de la secuencia en los procariotas. Kosak realizó un estudio detallado sobre el papel de la mutagénesis dirigida al sitio adyacente de ATG, la transcripción y traducción del codón de inicio, y concluyó que las secuencias más eficientes alrededor de ACCATGG son la transcripción y traducción en eucariotas, especialmente -3. La eficiencia de entrada de A es muy importante. Construya secuencias compradas, llamadas secuencias cosacas, para usarlas en vectores de expresión. Por ejemplo, los niveles de expresión del gen de la quitinasa bacteriana, con la secuencia UUUAUGG que rodea el codón de inicio original, aumentaron ocho veces en el tabaco. Por lo tanto, los vectores de expresión que utilizan construcciones genéticas de fuentes no vegetales deben basarse en las características de la secuencia que rodea el codón de inicio de la planta que se va a transformar.
La región codificante del gen 2.3 se transforma.
Si los genes extraños provienen de procariotas, los niveles de expresión de estos genes en las plantas suelen ser muy bajos debido a diferencias en los mecanismos de expresión. Por ejemplo, el gen de la proteína insecticida del Bacillus thuringiensis de tipo salvaje tiene una expresión muy baja en las plantas. Se descubrió que las diferencias en la estabilidad del ARNm de genes procarióticos y vegetales se debían a una reducción Bajo la premisa de Perlak de Monsanto, la secuencia de aminoácidos de la proteína venenosa permanece sin cambios, la transformación genética de la proteína insecticida, la selección de codones de la planta, el contenido de GC y la deleción de elementos en la secuencia original que afectan la estabilidad. Como resultado, el nivel de expresión de la proteína venenosa en las plantas transgénicas aumentó de 30 a 100 veces.
Tres
Eliminación de efectos de posición Tras eliminar genes extraños, las plantas receptoras suelen tener niveles de expresión muy diferentes en diferentes plantas transgénicas. Esto es el resultado de que el gen extraño tiene sitios de inserción muy diferentes en el genoma de la planta receptora. Éste es el llamado "efecto de posición". Para eliminar el efecto de posición, el gen extraño es un vector de expresión en la región transcripcionalmente activa del genoma de la planta. Las estrategias de construcción actuales generalmente consideran la integración de regiones de unión de la matriz nuclear y técnicas de integración específicas del sitio.
Una región de unión a matriz nuclear (MAR) es una secuencia de ADN que se une a una porción específica de la matriz nuclear de la cromatina de células eucariotas. Generalmente, la secuencia MAR se encuentra en la estructura circular del ADN transcripcionalmente activo. Su función es permitir la función de división para que cada unidad de transcripción se vea afectada por la cromatina circundante y mantenga un límite relativamente independiente. Este estudio muestra que transformar genéticamente la estructura que contiene genes MAR en ambos lados de MAR en la construcción genética requerida para los vectores de expresión de plantas puede mejorar significativamente el nivel de expresión del gen objetivo, reducir la diferencia en los niveles de expresión entre diferentes plantas transgénicas y reducir la efecto de este efecto. Por ejemplo, Allen et al. estudiaron la expresión de los genes Gus MAR heterólogo (de levadura) y MAR homólogo (de tabaco) en el tabaco y descubrieron que el MAR de levadura puede aumentar el nivel promedio de expresión del transgén 12 veces, y el propio MAR del tabaco puede aumentar. aumentar la expresión del transgén. El nivel promedio de expresión aumentó 60 veces. El gen de la lisozima de pollo de MAR también puede desempeñar el mismo papel.
Otro enfoque posible es utilizar tecnología de integración orientada al sitio. El principio fundamental de esta tecnología es modificar el cromosoma del vector huésped e integrar la región homóloga de un fragmento de ADN específico en el cromosoma mediante la recombinación homóloga de genes extraños. De hecho, se construye un vector de expresión vegetal cuando se construye el fragmento de ADN de la primera región activa transcripcional cromosómica aislada. La integración dirigida de microorganismos de recombinación homóloga se ha convertido en una operación genética rutinaria. Los vectores de expresión de genes extraños en cloroplastos en plantas también se han integrado con éxito en animales. Sin embargo, hay pocos casos exitosos de integración extraña dirigida utilizando métodos de transformación nuclear.
4. Construcción del vector de expresión del cloroplasto
La transformación nuclear exógena se utiliza a menudo para superar la expresión génica. Debido a problemas de comportamiento sexual inseguro, como el efecto posicional de la transmisión del polen por genes nucleares, sólo en los últimos años ha aparecido una nueva tecnología de transformación genética, la transformación de cloroplastos, cuyas ventajas y perspectivas de desarrollo son cada vez más reconocidas por la gente. atención. Hasta ahora se han publicado cinco transformaciones de cloroplastos en tabaco, arroz, Arabidopsis, patata y colza (Hou Bingkai et al.), lo que convierte esta tecnología de transformación en un nuevo punto de crecimiento en la ingeniería genética vegetal.
Se ha determinado que genes extraños de varias secuencias del genoma del cloroplasto de plantas se integran en el genoma del cloroplasto en sitios específicos, sentando las bases para el mecanismo de recombinación homóloga. Los vectores de expresión de cloroplastos actualmente construidos son básicamente específicos de sitio. vectores de integración. La construcción de un vector de expresión de cloroplasto es básicamente un vector de ejemplo. Para generar un casete de expresión de gen extraño universal para el vector de expresión del cloroplasto, ambos lados de la secuencia de ADN del cloroplasto en cada etapa de ligación se denominan fragmentos de recombinación homóloga o fragmentos de posicionamiento (fragmentos direccionales). Cuando el vector se introduce en el cloroplasto, los dos fragmentos tienen el mismo fragmento de recombinación homóloga en el genoma del cloroplasto, que es un lugar específico para que genes extraños se integren en el genoma del cloroplasto.
Para mejorar los cultivos, la transformación del cloroplasto requiere recombinación homóloga. La secuencia original del genoma del cloroplasto insertado en el gen extraño no se perderá ni se destruirá el punto de inserción del gen original. Para cumplir con este requisito, el trabajo existente ha seleccionado fragmentos de recombinación homóloga de dos genes adyacentes, como el gen rbcL/ACCD 16 strnv/rpsl 2 PS 7 psba/variante 1, rps7/ndhB. Después de que se produce la recombinación homóloga con el gen extraño designado, se insertan dos intervalos de genes adyacentes para garantizar que la función original del gen no se vea afectada. Recientemente, Daniel et al. utilizaron fragmentos de recombinación homóloga del ARNt del genoma del cloroplasto del tabaco y trnI para construir un vector universal. Debido a que las secuencias de ARNt y ADN trnI están altamente conservadas en las plantas superiores, los autores sugieren que este vector puede usarse para la transformación de cloroplastos en varias plantas. Si se confirma la versatilidad de este vector, este trabajo será sin duda una buena idea para construir un nuevo, cómodo y práctico vector de expresión de cloroplastos.
La expresión de genes extraños integrados en el genoma del cloroplasto se debe a menudo al elevado número de copias del genoma del cloroplasto. En el primer ejemplo, McBride et al. introdujeron el gen de la toxina cryIA(c) de Bt en hojas de proteína de toxina BT del cloroplasto de tabaco con una eficiencia de hasta 3% a 5%, mientras que la tecnología de transformación nuclear típica solo puede alcanzar de 0,001% a 0,6%. % de expresión proteica total. Recientemente, se introdujo el gen Bt Cry2Aa2 en los cloroplastos del tabaco en Kota Kinna. También se encontró que el nivel de expresión de proteínas tóxicas en las hojas de tabaco representa del 2% al 3% de las proteínas solubles, lo que es de 20 a 30 veces mayor que la transformación nuclear. El tabaco modificado genéticamente no sólo resiste a los insectos sensibles, sino que también mata a los insectos muy resistentes. Staub informó recientemente que el nivel de expresión del gen de la hormona del crecimiento humano introducido en los cloroplastos del tabaco llega al 7% de la proteína de la hoja, que es más de 300 veces mayor que el del método de transformación nuclear. Estos experimentos construyeron y transformaron completamente vectores de expresión de cloroplastos, lo cual es una forma importante de lograr una expresión de alto nivel de genes extraños.
5 aplicaciones de señales de posicionamiento
El objetivo principal de la estrategia de optimización de vectores anterior es mejorar la eficiencia de transcripción y traducción de genes extraños. Sin embargo, es necesario considerar otras cuestiones importantes con respecto a la acumulación de transformación genética en las plantas, si las proteínas extrañas pueden expresarse de manera estable en niveles elevados en las células vegetales.
Investigaciones recientes han descubierto que si un gen extraño se coloca correctamente en una secuencia señal conectada, la proteína extraña puede ser dirigida y transportada a sitios específicos de la célula, como los cloroplastos y las células endoteliales. vacuola, etc. , puede mejorar significativamente la estabilidad del sistema y la acumulación de proteínas extrañas. ¿Esto se debe a un área específica? El retículo endoplasmático de ciertas proteínas extrañas proporciona un entorno relativamente estable que puede prevenir eficazmente la degradación de proteínas extrañas. Por ejemplo, antes de que la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad de Arabidopsis Rubisco de Wong et al. se conectara al gen de la proteína insecticida acumulada en los cloroplastos de tabaco transgénicos con una proteína insecticida específica, la acumulación total de proteínas extrañas era de 10 a 20 veces mayor que esa. de los tiempos del grupo control. Recientemente, Liang Ye y Wang Songruyan conectaron la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad rbcS al gen de síntesis previa a PHB en un intento de acumular el producto genético en germoplasma de colza transgénica, aumentando así el contenido de proteínas extrañas. , Wandelt y Stern vincularon el retículo endoplásmico y descubrieron que la secuencia del gen de la proteína extraña (secuencia codificante del tetrapéptido KDEL) aumentaba significativamente el contenido de proteína extraña en las plantas transgénicas. Obviamente, la señal de localización juega un papel positivo en la promoción de la acumulación de proteínas, pero es necesario determinar más a fondo si la misma señal de localización es aplicable a todas las proteínas.
6 Los intrones potencian la expresión génica. Los intrones potencian la expresión génica. Callis et al descubrieron por primera vez el maíz modificado genéticamente. El primer intrón (intrón 1) del gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz (ADHL) mejora significativamente la expresión de genes exógenos, y otros intrones (como el intrón 9) también tienen un cierto efecto promotor. Más tarde, Vasil Lev también descubrió el primer intrón, que aumentó 10 veces el nivel de expresión del gen CAT de la fructosa sintasa del maíz. El tercer intrón, el gen de la actina del arroz, también puede estar compuesto por 2? El nivel de expresión del gen indicador aumentó 6 veces. El mecanismo por el cual los intrones de azufaifa mejoran la expresión genética no está claro, pero en general se cree que la presencia de intrones puede mejorar la eficiencia del procesamiento y la estabilidad del ARNm. Tanaka et al. han demostrado que el efecto de mejora de los intrones sobre la expresión genética ocurre principalmente en monocotiledóneas y dicotiledóneas y no es obvio.
Debido a la mejora de los intrones, Mcelroy construyó un vector de expresión monocotiledónea. En particular, el primer intrón del gen de la actina del arroz mantuvo la expresión de los genes aguas abajo del promotor. De manera similar, el gen del primer intrón de la ubiquitina del maíz construido por Christensen et al. se colocó corriente abajo del promotor para mejorar la expresión de genes extraños en monocotiledóneas. Sin embargo, se ha señalado que la influencia de la fuerza del promotor, el tipo de célula, la secuencia del gen diana y otros factores en la expresión génica depende de la función de un intrón específico y, a veces, incluso depende de la posición del intrón en el vector. Por ejemplo, el gen ADHL 9 del maíz está situado en el extremo 5' del gen GUS y no se potencia bajo el control del promotor CaMV35S del gen Gus. El gen gus en el intrón se colocó en el extremo 3' del intrón y el nivel de expresión del gen gus aumentó aproximadamente 3 veces bajo el control del mismo iniciador. El mecanismo de expresión genética a partir de intrones puede ser muy complejo.
Se puede ver que falta un modelo fijo sobre cómo establecer vectores de expresión de intrones en plantas eficientes y merece más estudio.
Política de control de poligenes
Hasta ahora, la mayoría de los estudios han implicado la transformación genética de plantas receptoras mediante la introducción de un único gen exógeno. Pero lo suficientemente potente, a veces debido a la expresión de un único gen o de un único mecanismo de acción, no se obtiene la planta transgénica ideal. Si dos o más genes tienen un efecto sinérgico en las plantas al mismo tiempo, se obtendrán mejores resultados de transformación que con un solo gen. Esta estrategia se ha utilizado para cultivar plantas transgénicas con resistencia a enfermedades, resistencia a insectos y tolerancia al estrés. Por ejemplo, basándose en los diferentes mecanismos del espectro de insectos y la función de los genes resistentes a los insectos, se construyen dos vectores con funciones complementarias y los dos genes resistentes a los insectos se introducen en las plantas de una determinada manera. Wang Wei, junto con otros genes de lectinas y genes inhibidores de proteasas, fueron transferidos simultáneamente a plantas de algodón transformadas que ya contenían genes bivalentes de resistencia a insectos. La introducción del gen de la proteína insecticida Bt de Barton y del gen de la toxina del escorpión en el tabaco mejora en gran medida la resistencia de los insectos y evita que las plagas desarrollen resistencia (patentado). Aprovechando la fuerte resistencia a las enfermedades, nuestro laboratorio en Lanyan construyó un vector de expresión vegetal que contenía un gen bivalente de β-1,3-glucanasa y un gen de quitinasa, y lo introdujo en semillas de colza y algodón. Los resultados mostraron que las plantas transgénicas tenían una resistencia evidente. Recientemente, Feng Daorong, Li Baojian 2? Los tres genes antifúngicos y el gen hpt están incluso en el vector. ¿Están el gen de resistencia a los insectos y el gen bar conectados a otro vector? Los resultados de la introducción conjunta del arma genética en el arroz mostraron que el 70% de la progenie de R contenía el gen extraño introducido. (6? 7), y la tendencia de uno o dos loci genómicos del gen extraño introducido a integrarse.
En general, es imposible introducir fragmentos de ADN extraños de más de 25 KB en células vegetales. Los genes funcionalmente relacionados, como los loci de rasgos cuantitativos en los genes de resistencia a enfermedades de las plantas, existen principalmente en forma de grupos de genes. Si algunos fragmentos de ADN grandes de más de 100 KB, como grupos de genes de cromosomas vegetales naturales o una serie de genes extraños en cadenas sin fase, se introducen en el mismo punto del genoma de la planta, puede ocurrir un fenómeno controlado por múltiples genes. Excelentes rasgos pueden producir resistencia a insectos y enfermedades de amplio espectro, obtener nuevas vías metabólicas y producir nuevas biomoléculas en las células receptoras. Además, los fragmentos grandes de grupos de genes o la inserción sincrónica de grupos de genes también pueden superar en cierta medida el efecto de posición causado por los transgenes y reducir la aparición de fenómenos indeseables como el silenciamiento de genes. Recientemente, Hamilton y Alfred desarrollaron un sistema de vectores de nueva generación para clonar grandes fragmentos de ADN y transformar directamente plantas BIBAC y TAC con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens. Estos dos operadores no sólo deberían acelerar la clonación de mapas genéticos, sino también controlar múltiples genes, de modo que la mejora genética pueda tener aplicaciones potenciales. La investigación actual sobre su aplicación en la transformación multigénica acaba de comenzar. Sobre los vectores BIBAC y TAC
8 Selección de genes marcadores a utilizar y eliminar
Selección de genes marcadores Las células (o individuos) transformables en transformación genética se seleccionan entre un gran número de no transformadas Genes marcadores de células. A menudo producen células transgénicas que son resistentes al producto seleccionador. Por lo tanto, las células transgénicas en un medio de crecimiento normal suplementado con esta selección exhiben sensibilidad a este agente selectivo debido a una falta de resistencia más que a un crecimiento, desarrollo y diferenciación. En el vector, se construyen y seleccionan los lados unidos del gen marcador, ambos con sus propias secuencias reguladoras de genes (como promotores, terminadores, etc.). Hay dos tipos principales de genes marcadores seleccionables: genes de resistencia a antibióticos y genes de resistencia a herbicidas. genes. Lo primero puede provocar resistencia a los antibióticos y lo segundo puede provocar resistencia a los herbicidas. Los genes de resistencia a los antibióticos utilizados incluyen el gen NPTII (resistencia a la higromicina), el gen Gent que produce higromicina fosfotransferasa (neomicina fosfotransferasa, resistencia a la kanamicina) y el gen HPT (que produce resistencia a Gent ADM). Genes de resistencia a herbicidas, incluidos los genes EPSP (produce 5-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa, glifosato), genes GOX (degrada el glifosato a través de la glifosato oxidasa) y genes bar (produce PPT acetil transferasa, resistencia al bialafos o al glufosinato).
Los 1, 2, 3, 5 y 6 anteriores son todos dignos de elogio, especialmente porque puede elegir PB I121 como portador de la columna vertebral de secreción extracelular y luego puede cambiar el genotipo del mismo.
Los pasos de clonación son relativamente sencillos.
1, el primer sitio de restricción para obtener el gen deseado y es un buen vector para cargar cambios.
2 Transformación del plásmido en amplificación de Escherichia coli DH5α
Transforma células vegetales con un plásmido bien amplificado
4. Recoge líquido de cultivo extracelular para detectar la expresión y secreción de proteínas. Sí
En cuanto al vector de transformación, bastarán unas pocas palabras. Después de responder, si realmente construye un buen operador, puede iniciar su propia empresa.