Descubra los pros y los contras de la tecnología RNAi y la tecnología TALEN
El shRNA puede expresar eficientemente proteínas en células difíciles de transfectar, como células madre, células neurales y células madre embrionarias. Todos sus promotores son exógenos y la modificación postraduccional de la proteína expresada puede no ser lo suficientemente realista como para compensar mejor sus deficiencias. Primero, se construye el módulo de reconocimiento de objetivos. La unidad de reconocimiento de ácido nucleico de TAL es una secuencia constante repetida de 34 aminoácidos, en la que los aminoácidos dobles en las posiciones 12 y 13 tienen una correspondencia constante con A, G, C y T, es decir, ng reconoce T, HD reconoce C , NI reconoce A y NN Identificación de G.. Para obtener TALE para la identificación de secuencias de ácidos nucleicos específicas, solo es necesario clonar continuamente las unidades TAL correspondientes en función de la secuencia de ADN. Como las especies varían en el tamaño del genoma, la longitud de la secuencia específica elegida también varía. Para los mamíferos, incluidos los humanos, generalmente se seleccionan secuencias de ADN de 16-20 pb como dianas de reconocimiento. En segundo lugar,
Inactivación del gen Talen
La endonucleasa TALEn se puede construir acoplando Tale, que reconoce una secuencia de ADN específica, a la endonucleasa FokI. Además, FokI necesita formar un dímero para estar activo, lo que reduce en gran medida la probabilidad de corte aleatorio. En la operación real, debe seleccionar dos secuencias objetivo adyacentes (con una separación de 13 a 22 bases) (generalmente de 16 a 20 bases) en la región codificante del gen objetivo o en la unión de exones e intrones. Construya el módulo de identificación TAL por separado. Se fusionaron y clonaron dos módulos de reconocimiento de objetivos adyacentes en el extremo N de FokI para formar un vector de expresión eucariótico y obtener un par de plásmidos TALEN.
Los genes diana pueden eliminarse transfiriendo pares de plásmidos TALEN a las células. Después de que * * * se transfiere a las células a través del plásmido TALEN, las proteínas de fusión expresadas se unen específicamente al sitio objetivo. Debido a que las FokI en las dos proteínas de fusión TALEN están cerca entre sí, forman un dímero y ejercen una actividad endonucleasa no específica, cortando el ADN entre los dos sitios objetivo, formando una DSB (rotura de doble hebra) e induciendo la reparación del daño del ADN. . mecanismo. Las células pueden reparar el ADN a través de NHEJ (unión de extremos no homocigotos). Durante este proceso de reparación, una cierta cantidad de bases se eliminan o insertan más o menos, lo que resulta en un cambio de marco y la formación de mutantes knockout del gen objetivo.
La activación transcripcional de TALEA
TALE, que reconoce secuencias de ADN específicas, se fusiona con el dominio de activación del factor de transcripción VP64 para construir el activador transcripcional TALEA, que reconoce secuencias de ADN específicas en el promotor. . En la operación real, es necesario seleccionar la secuencia objetivo (generalmente 12-18 bases) aguas arriba del promotor del gen objetivo para construir el módulo de reconocimiento TAL. El módulo de reconocimiento TALE se fusionó y clonó en el extremo N de VP64 para formar el plásmido de expresión eucariota TALE. El plásmido TALEN se transfiere a las células y la proteína de fusión expresada se une a secuencias de ADN específicas cerca del promotor y se une a Pol II a través de la región de activación VP64, activando así la transcripción genética y aumentando la expresión de genes diana endógenos.