Detección rápida, precisa y de alto rendimiento de derivados que contienen segmentos IgG y Fc mediante el método de polarización de fluorescencia

Detección rápida, precisa y de alto rendimiento de derivados que contienen segmentos IgG y Fc mediante el método de polarización de fluorescencia

Dra. Carolanne Doherty

Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublín, Irlanda

El lector de microplacas multifuncional BMG se puede aplicar a la nueva tecnología Valita?TITER para la cuantificación de IgG. Utiliza el método de polarización de fluorescencia para detectar directamente IgG en el sobrenadante de cultivo celular.

Los programas de detección preestablecidos del lector de microplacas y las plantillas de análisis de datos aumentan la velocidad de la investigación

Introducción

Detección precisa, rápida y de alto rendimiento de IgG para la mayoría de los desarrollos terapéuticos y la producción de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales están dejando su huella en el campo de los productos biofarmacéuticos y un gran número de muestras esperan ser analizadas para un mayor desarrollo. Aquí presentamos una nueva tecnología de detección para la cuantificación directa de IgG en sobrenadante de cultivo celular: Valita?TITER.

Las tecnologías existentes, incluida la cromatografía líquida de alto rendimiento de la proteína A (proteína A HPLC), la tecnología ELISA, el método de interferencia de superficie de la proteína A y la HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo), tienen deficiencias obvias, incluido el precio. , requiere mucha mano de obra y mucho tiempo.

El método Valita?TITER es un método nuevo, muy preciso y de bajo coste para la detección de IgG, con un rango de detección de 2,5-80mg/L. Valita?TITER utiliza tecnología de polarización de fluorescencia para detectar la unión del segmento Fc de IgG a la proteína G (Figura 1). El análisis se realiza en una placa de 96 pocillos, que es sencilla, de alto rendimiento, rápida y puede automatizarse. Los ensayos se pueden realizar en cantidades muy pequeñas de medio de cultivo celular y sin una preparación tediosa.

En esta nota de aplicación, presentamos el protocolo para la detección cuantitativa de IgG utilizando el kit Valita? TITER en lectores de microplacas multifunción PHERAstar?, POLARstar?

La polarización de fluorescencia puede analizar eficazmente los cambios en el tamaño molecular. Un fluoróforo "inmóvil" emitirá fluorescencia en la misma dirección de polarización que la luz de excitación cuando se excita con luz polarizada. Sin embargo, la dirección de polarización de la fluorescencia del fluoróforo giratorio cambiará hasta cierto punto en comparación con la dirección de polarización de la luz de excitación. Las moléculas pequeñas giran más rápido que las moléculas grandes en solución. Por lo tanto, los cambios en el tamaño de las moléculas conectadas a grupos fluorescentes se pueden medir mediante el grado de despolarización de la fluorescencia. Por tanto, cuando la proteína G marcada con fluorescencia no está unida a otras moléculas, rota más rápido y se despolariza más, mientras que ocurre lo contrario (5 veces más grande) cuando se une a IgG (Figura 2). Este cambio de polarización se utiliza para detectar IgG en solución. La polarización de fluorescencia (FP) se realiza iluminando una solución con luz de excitación en una dirección de polarización paralela y midiendo la fluorescencia emitida en direcciones paralela y perpendicular. FP es la diferencia normalizada entre las dos fluorescencias polarizadas, generalmente expresada en mP.

Materiales y métodos

Kit de análisis Valita?TITER

Software APP Valita?TITER (incluido en el kit)

Productos estándar de IgG (IgG obtenida de suero humano)

Lectores de microplacas multifunción PHERAstar, POLARstar Omega y CLARIOstar (BMG LABTECH)

Proceso experimental

Preparación de muestras Seguir las instrucciones adecuadas requisitos en las instrucciones del kit. La curva estándar se dibuja utilizando el método en el que cada valor de fluorescencia relativa corresponde a un estándar de IgG. Agregue 60 µl de tampón de reconstitución y 60 µl de estándar o muestra a cada pocillo de la microplaca Valta?TITER. Mezclar bien e incubar en la oscuridad durante 30 minutos.

Luego use el programa de detección preestablecido para leer en el lector de microplacas multifuncional POLARstar Omega, PHERAstar o CLARIOstar (BMG LABTECH Company) (consulte la tabla a continuación para conocer la configuración de los parámetros). Convierta los datos brutos obtenidos en un archivo de formato .csv en el software de análisis MARS y luego utilice el software Valita APP para el análisis.

Configuración del instrumento

Resultados y discusión

La curva estándar (2,5-80 mg/L) en la Figura 3 se obtiene de BMG LABTECH Company con función de detección de polarización de fluorescencia. Trazado utilizando el kit Valita?TITER en lectores de microplacas multifuncionales (POLARstar Omega, CLARIOstar y PHERAstar). Los resultados obtenidos por todos los lectores de microplacas son muy estables.

Finalmente, utilizamos muestras cultivadas en diferentes condiciones para comparar los resultados de la cuantificación de IgG mediante Valita?TITER con los resultados de HPLC mediante métodos convencionales. La Figura 4 muestra la correlación de los resultados de medición de los dos métodos, lo que muestra que ambos métodos cuantitativos tienen buena precisión y que el análisis Valita?TITER es más rápido porque no requiere tediosos procesos de preparación de muestras.

Conclusión

La determinación rápida de la concentración de IgG en muestras mixtas es muy importante en el desarrollo y producción de este tipo de productos biofarmacéuticos. Aquí presentamos una nueva tecnología para la determinación rápida y sencilla de alto rendimiento de derivados de segmentos IgG y Fc basada en el método de polarización de fluorescencia: el método de análisis Valita?TITER. El ensayo Valita?TITER puede cuantificar directamente la IgG en la muestra que se va a analizar sin la necesidad de engorrosos procesos de preparación o purificación de la muestra. CLARIOstar, PHERAstar y POLARstar Omega logran un rendimiento excelente cuando se utilizan en el análisis Valita?TITER. En comparación con otros métodos cuantitativos de IgG, Valita?TITER tiene las características de alto rendimiento, simple, preciso y rápido.

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Si desea saber más sobre la aplicación de la multifunción BMG lector de microplacas, visite el sitio web oficial de BMG (ID de WeChat: Bio-Gene) Ingrese las palabras clave relacionadas con el lector de microplacas BMG (no es necesario ingresar el número de serie): 1. Metabolismo celular 2. Flujo de calcio; 4. HTS; 5. FRET y BRET; 6, BMG; 7. Operación BMG; 8. Agregación de proteínas.

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