Cuénteme sobre la prueba de anticuerpos contra la rabia RFFIT
En febrero de 1996, por invitación del Dr. Jiang Anli, el investigador Yan Jiaxin de nuestra oficina fue al Instituto Pasteur en Francia para estudiar la tecnología de detección de antígenos y anticuerpos del virus de la rabia, y trajo muchos materiales y materiales. donado por el Dr. Jiang Anli Materiales experimentales.
En marzo de 1996, el Dr. Jiang Anli volvió a hacer un viaje especial a nuestro hospital. En los diez años siguientes, el Dr. Jiang Anli visitó China todos los años; su sucesor, el Dr. Burch, también visitó China muchas veces para realizar investigaciones sobre la epidemiología molecular del virus de la rabia y reactivos de diagnóstico relacionados con nuestro hospital, y ayudó a nuestro hospital a establecer una de clase mundial Ha establecido un centro de pruebas de rabia de acuerdo con los estándares de la OMS, ha capacitado a estudiantes de doctorado y ha solicitado financiación para proyectos de investigación con instituciones europeas y otras instituciones.
Los resultados de la investigación de este artículo demuestran una vez más que la repetibilidad, especificidad y sensibilidad de RFFIT no son inferiores a las de MNT (prueba de neutralización en ratón), y es más rápido, más barato y más sencillo, y puede utilizarse en en la mayoría de los casos, el MNT se puede sustituir cuando se requieren anticuerpos neutralizantes del VD.
1998 Octubre El curso chino-francés de capacitación en diagnóstico y control de la rabia iniciado y organizado por el Dr. Jiang Anli y el Dr. Bourhy y apoyado por PRA (Programa Chino-Francés de Investigación Avanzada) se llevó a cabo en el Instituto de Enfermedades Infecciosas. Enfermedades de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de China (Beijing) (organizado por Tang Qing). Yan Jiaxin y Xu Gelin de nuestro hospital participaron en esta capacitación.
Los productos de este laboratorio han sido enviados al Centro Colaborador y de Referencia contra la Rabia de la OMS del Institut Pasteur en Francia cuatro veces para su uso de prueba, y la especificidad y sensibilidad de los resultados son superiores a productos extranjeros similares. En varios seminarios y talleres nacionales sobre rabia en nuestro país, los métodos que establecimos y los reactivos que preparamos han sido bien recibidos, y se han realizado una gran cantidad de pruebas comparativas de campo con reactivos extranjeros, demostrando que el efecto es igual o mejor. pero el costo es significativamente mayor. A lo largo de los años, el Instituto Pasteur de Francia no sólo ha comprado una gran cantidad de kits de detección producidos por nosotros, sino que también ha adquirido nuestros anticuerpos monoclonales (materias primas) para investigaciones relacionadas.
Los reactivos de detección del virus de la rabia preparados por nuestro laboratorio han sido exportados a Francia, Túnez, Grecia, Irán y otros países para su uso en el diagnóstico de laboratorio de la rabia. Según los comentarios de los usuarios, la sensibilidad de detección de nuestros productos es superior a la de reactivos extraños similares.
(Este trabajo fue supervisado técnicamente por el Dr. Herry Tsiang, Director del Centro Colaborador y de Referencia contra la Rabia de la OMS en el Instituto Pasteur de Francia, y fue parcialmente financiado por la Compañía Francesa de Vacunas de Suero Pasteur Merieult (PMSV). )
A partir de la primera preparación de anticuerpos marcados con fluorescencia de la nucleoproteína (NP) del virus de la rabia (RV) en China, se estableció una prueba rápida de inhibición del foco de fluorescencia (RFFIT) para detectar anticuerpos neutralizantes del RV. No hubo diferencias significativas en reproducibilidad, especificidad y sensibilidad en comparación con la prueba de neutralización en ratón (MNT). Este método puede reemplazar a la MNT en la mayoría de los casos en los que se requiere la detección de anticuerpos neutralizantes del RV.
La rabia sigue siendo un problema grave en China y muchos países en desarrollo [1-3], por lo que existe una necesidad urgente de establecer y promover varios métodos de detección rápidos y prácticos relacionados con el virus de la rabia (RV). El comité de expertos de la OMS afirmó y recomendó la prueba de neutralización en ratón (MNT) y RFFIT como los dos métodos básicos para detectar anticuerpos neutralizantes del VD [4], y recomendó que se utilice RFFIT para reemplazar MNT tanto como sea posible porque el primero es más rápido y más barato. , y La sensibilidad es comparable a la de MNT. RFFIT requiere un anticuerpo fluorescente contra la nucleoproteína (NP) del VD. Basándonos en la exitosa producción de prueba de este reactivo clave en China [5], establecimos el método micro-RFFIT y comparamos la reproducibilidad, especificidad y sensibilidad de este método con MNT. Se espera que este método se utilice ampliamente en el diagnóstico clínico de la rabia, el control de calidad de las vacunas y la investigación epidemiológica. Los resultados experimentales relevantes se informan a continuación.
Células BHK21/BSR, cepa CVS del virus de desafío RV (ATCCVR959) adaptada a esta línea celular, suero estándar anti-RV con título neutralizante conocido (UI/ml) (número de lote I-1995-10-11 ) Producido por la Compañía Francesa Pasteur.
El Dr. Xiao Dingchang de nuestra oficina proporcionó suero humano antes y después de la vacunación con la vacuna RV (VERORAB producida por Merieult Serum Vaccine Company en Pasteur, Francia o vacuna RV producida por nosotros).
Medio de cultivo celular: D-MEM, producto GibcoBRL. Portaobjetos de cultivo celular Lab-Tak, productos Nunc. Placa de cultivo celular de fondo plano Falcon de 96 pocillos. Microscopio de fluorescencia Opton. El estándar de referencia para anticuerpos anti-RVNP marcados con fluorescencia es el producto de Sanofi Diagnostic Products Company, Pasteur, Francia (número de lote 6E022U), denominado pNF en este artículo. El producto correspondiente fabricado en este laboratorio se denomina mNF en este artículo; consulte [5]; cuando no se indique pNF en este artículo, se utiliza mNF.
Titulación rápida de RV en cultivo de tejidos Según la literatura [5-6], la muestra de RV a analizar se infecta con células BSR después de una dilución seriada y se puede detectar en 24 horas (virus fijados). o 48 horas (virus callejero) Fluorescencia de cuerpos de inclusión (NP compuestas principalmente de RV) en el citoplasma. Normalmente, se examinan 20 campos (cuando se utilizan portaobjetos Lab-Tak) u 8 campos (cuando se utilizan placas de cultivo celular de 96 pocillos) bajo un microscopio de baja potencia (160X). Los títulos se calcularon utilizando el método de Reed & Münch y se expresaron en unidades de foco de fluorescencia (UFF/ml). Se usaron cepas CVS para desafiar el virus durante RFFIT. La dosis de desafío óptima del virus fue la dilución más alta que pudiera infectar el 80% de las células (producir cuerpos de inclusión fluorescentes) después de 24 horas de incubación.
Incubar una cantidad fija de virus CVS con una serie de suero diluido a analizar (incluido un suero de referencia de título conocido) (reacción de neutralización in vitro), y luego añadir la suspensión de células sensibles (BSR). Después de 24 h de incubación, las monocapas celulares se fijaron con acetona y se tiñeron con anticuerpos anti-NP fluorescentes para detectar la presencia de virus no neutralizado (foco fluorescente). En comparación con el grupo de control de virus, reduzca la dilución de la cantidad fijada de virus CVS en FFU/ml de cada suero a analizar en un 50 % y luego compárelo con el suero de referencia de título conocido para calcular la eficacia de los anticuerpos neutralizantes de cada uno. Precio del suero a probar.
Se dividieron alícuotas de la misma cepa de virus CVS y se almacenaron a 70 °C, y su título se midió 6 veces con mNF y pNF en un plazo de medio año. Los resultados son bastante estables y no hay diferencia entre ellos (para la dilución de virus 1103,5, t=0,445, P0,05; para la dilución de virus 1104,2, T=0,353, P0,05, consulte la Tabla 1). Se determinó que el título de virulencia de esta cepa CVS en ratones era 5,5 logd 50/ml (Sm = 0,4 logd 50/ml), que puede usarse como estándar de referencia de virulencia para convertir el título de virulencia de muestras desconocidas en ratones (pequeño El El título de LD50 de ratón se puede convertir directamente en función de la relación entre el título de la muestra de VD desconocida y el título de la muestra de referencia en cultivo de tejidos, expresado en FFU/ml). La referencia de virulencia de CVS puede infectar el 80% de las células BSR después de 24 horas de incubación, y la dilución más alta es 1160, que se utiliza como dosis óptima de exposición al virus para RFFIT.
Utilizando como referencia el suero estándar anti-RV proporcionado por el Instituto Pasteur en Francia, los títulos neutralizantes del suero de referencia A y B se midieron cuatro veces con RFFIT y MNT respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla. 2. No existe una diferencia significativa entre los dos métodos (para la muestra A, t = 0,444, P0,05 para la muestra B, t = 0,768, P0,05). Se puede considerar que los resultados obtenidos por los dos métodos son básicamente consistentes. .
Utilice RFFIT (mNF y pNF se utilizan en paralelo) y MNT (sólo ver si el título neutralizante de la muestra es superior a 0,5 UI/ml) para determinar el título neutralizante del RV de 52 muestras de suero humano antes. y después de haber sido vacunado con vacuna RV. En la determinación de RFFIT, la tasa de coincidencia (52/52) de los títulos de anticuerpos fluorescentes obtenidos por mNF y pNF fue del 100%, mientras que la tasa de coincidencia (51/52) de RFFIT y MNT fue superior al 98%. Se determinó que una muestra no compatible era negativa y se volvió a analizar mediante RFFIT con un título ligeramente por encima del límite (0,5 UI). Esto también muestra que la sensibilidad de RFFIT puede ser ligeramente mayor que la de MNT.
También se analizaron los títulos de anticuerpos neutralizantes del RV de 18 muestras de suero recolectadas en diferentes momentos de personas vacunadas con la vacuna VERORAB (No. 37 y 45) y la vacuna contra el RV producida por nosotros (No. 121). . Los resultados mostraron que los títulos del mismo suero medidos por RFFIT y MNT eran básicamente los mismos. La mayoría de los resultados son idénticos en comparación con la media aritmética correspondiente.
El mNF preparado en este laboratorio tiene un bajo coste y un efecto estable. En las pruebas de aplicación anteriores, la especificidad y sensibilidad fueron exactamente las mismas que las del producto correspondiente pNF de Sanofi Diagnostic Products Company de Pasteur, Francia. Las pruebas comparativas de estos dos reactivos en el Centro Colaborador y de Referencia sobre la Rabia de la OMS en el Instituto Pasteur de Francia también obtuvieron los mismos resultados (H. Tsiang, comunicación personal).
Los principios y resultados del método RFFIT basado en la aplicación de anticuerpos anti-NP marcados fluorescentemente son altamente consistentes con los MNT (ambos detectan específicamente anticuerpos neutralizantes protectores contra el RV), y son más rápidos que los MNT (el método experimental el tiempo pasa de 14 días reducido a 2 días laborables), más económico y reproducible, por lo que ha sido afirmado y recomendado por la OMS [4] y se ha convertido en el MNT más aceptado a nivel internacional.
Fitzgerald et al. [8] realizaron un estudio colaborativo en tres laboratorios para comparar la reproducibilidad de MNT y RFFIT. Cuando se analiza la misma muestra en el mismo laboratorio, el rango de variación de MNT es del 67 % al 149 % y el rango de variación del RFFIT es del 68 % al 146 %. En este artículo, se utilizaron RFFIT y MNT para determinar los títulos neutralizantes de los sueros de referencia A y B, respectivamente, cuatro veces. Los rangos de variación de los resultados obtenidos por MNT para las muestras A y B son 81%-123% y 78%-129% respectivamente, y los rangos de variación de los resultados obtenidos por RFFIT para las muestras A y B son 83%-120 respectivamente. Los resultados muestran que la repetibilidad de RFFIT no es menor que la de MNT y no hay diferencias significativas en los resultados de detección de los dos métodos.
Zalan et al. [9] miniaturizaron el método RFFIT utilizando placas de cultivo celular de 96 pocillos en lugar de costosos portaobjetos de cultivo celular Lab-Tak. Su ventaja es que puede procesar una gran cantidad de muestras al mismo tiempo, lo que reduce en gran medida la cantidad de reactivos, facilita la observación de los resultados y reduce los errores de juicio. Los resultados de la investigación de este artículo también demuestran que este método de miniaturización tiene más ventajas y es digno de promoción.
En resumen, los resultados de este artículo demuestran una vez más que la reproducibilidad, especificidad y sensibilidad del RFFIT no son menores que las del MNT, y tiene las ventajas de ser más rápido, económico y sencillo. En la mayoría de los casos en los que es necesario detectar anticuerpos neutralizantes del RV, RFFIT puede reemplazar al MNT y se espera que se utilice ampliamente en la prevención y la investigación de la rabia en mi país.
5. Preparación y aplicación preliminar de anticuerpos marcados con fluorescencia contra la nucleoproteína del virus de la rabia, Actas de la Cuarta Conferencia Nacional de Productos Biológicos, Wuhan, 1997, P110.
8. Estudios de laboratorio sobre inmunoglobulinas en animales (humanas) mediante prueba de neutralización sanguínea (MNT) y prueba de inhibición del foco de fluorescencia ultraeficiente (RFFIT). Estación biológica, 1979, 7(1):67.
A partir de la preparación de la nucleoproteína (NP) del virus de almacenamiento de anticuerpos (RV) marcado con fluoresceína, se estableció una prueba de inhibición del enfoque de fluorescencia (RFFIT) para el estudio cuantitativo de anticuerpos neutralizantes y su reproducibilidad, especificidad y sensibilidad. se compararon con la prueba de neutralización (MNT).
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