Diseñar y construir un vector para expresar el gen objetivo en las raíces de las plantas y secretarlo fuera de las células de la raíz.
Construir genes extraños específicos en vectores de expresión de plantas y transferirlos a plantas receptoras no es el objetivo final de la transformación genética de plantas. Las plantas transgénicas ideales a menudo requieren una expresión de alto nivel de genes exógenos en sitios específicos y dentro de un tiempo específico para producir los rasgos fenotípicos esperados. Sin embargo, la historia del desarrollo de los últimos 20 años muestra que los genes extraños a menudo sufren fenómenos indeseables como baja eficiencia de expresión, productos de expresión inestables e incluso inactivación o silenciamiento de genes en plantas receptoras. Por lo tanto, las plantas transgénicas no pueden ponerse en práctica. Además, la seguridad de las plantas genéticamente modificadas ha causado preocupación en muchos países. Por ejemplo, las plantas genéticamente modificadas pueden transmitirse con el polen, y los genes marcadores de detección de antibióticos pueden hacer que algunos antibióticos sean clínicamente ineficaces. Los problemas mencionados ponen a la ingeniería genética vegetal de alta tecnología en un período difícil sin precedentes. En los últimos años, la gente ha explorado y mejorado la tecnología transgénica de plantas en muchos aspectos, y la mejora y optimización de los vectores de expresión de plantas es uno de los contenidos más importantes.
1 Selección y transformación del promotor
La expresión insuficiente de genes exógenos es a menudo una razón importante por la que no se pueden obtener plantas transgénicas ideales. Dado que los promotores desempeñan un papel clave en la determinación de la expresión genética, seleccionar un promotor vegetal apropiado y mejorar su actividad son las primeras consideraciones para mejorar la expresión de genes exógenos.
En la actualidad, los promotores muy utilizados en los vectores de expresión vegetales son los promotores constitutivos. Por ejemplo, la mayoría de las plantas transgénicas dicotiledóneas utilizan el promotor CaMV35S, mientras que las plantas transgénicas monocotiledóneas utilizan principalmente el promotor ubiquitina del maíz y el promotor Actinl del arroz. Bajo el control de estos promotores expresados constitutivamente, los genes extraños se expresarán en todas las partes de la planta transgénica y en todas las etapas de desarrollo. Sin embargo, la expresión continua de alta eficiencia de genes extraños en plantas receptoras no solo causa desperdicio, sino que a menudo también causa cambios morfológicos en las plantas y afecta su crecimiento y desarrollo. Para que los genes extraños desempeñen un papel eficaz en las plantas y reduzcan los efectos adversos en las plantas, la gente está prestando cada vez más atención a la investigación y aplicación de promotores de expresión específicos. Los promotores específicos descubiertos incluyen principalmente promotores específicos de órganos y promotores específicos de inducción. Por ejemplo, promotores específicos de semillas, promotores específicos de frutas, promotores específicos de células del mesófilo, promotores específicos de raíces, promotores inducidos por daños, promotores inducidos químicamente, promotores inducidos por luz, promotores inducidos por calor, etc. La clonación y aplicación de estos promotores específicos sienta las bases para la expresión específica de genes extraños en plantas. Por ejemplo, la empresa suiza CIBA-Gage utiliza el promotor PR-IA para controlar la expresión de genes de la toxina Bt en tabaco transgénico. Dado que el promotor puede ser inducido por ácido salicílico y sus derivados, obviamente es un método muy eficaz para inducir la expresión de genes resistentes a insectos mediante la pulverización de productos químicos baratos y no contaminantes durante la temporada en la que reaparecen las plagas.
En la investigación de plantas transgénicas, a menudo es imposible obtener resultados satisfactorios utilizando promotores naturales. Especialmente cuando se realiza expresión específica y expresión inducida, el nivel de expresión es mayoritariamente insatisfactorio. Transformar los promotores existentes y construir promotores compuestos será un enfoque muy importante. Por ejemplo, Ni et al. combinaron la región de activación transcripcional del promotor del gen de la octopina sintasa con el promotor del gen de la manolina sintasa. Los resultados de la expresión de GUS mostraron que la actividad del promotor modificado era significativamente mayor que la del promotor 35S. Wu Rui y otros combinaron el promotor del gen PI-II inducible con el intrón 1 del gen Actinl del arroz, y la actividad de expresión del nuevo promotor aumentó casi 10 veces (patente). Estos promotores construidos artificialmente desempeñan un papel importante en la investigación de ingeniería genética vegetal.
2. Mejorar la eficiencia de la traducción
Para mejorar la eficiencia de la traducción de genes extraños, los genes generalmente deben modificarse al construir vectores. Se deben considerar tres aspectos principales:
2.1 Añadir secuencia 5'-3' no traducida
Muchos experimentos han descubierto que la secuencia 5'-3' no traducida (UTR) de genes eucarióticos es muy necesaria para la expresión normal de los genes. La eliminación de este fragmento a menudo conduce a una disminución significativa en la estabilidad y el nivel de traducción del ARNm. Por ejemplo, aguas arriba del sitio de inicio de la traducción del gen de la proteína de 126 kda del virus del mosaico del tabaco (TMV), hay un elemento ω que consta de nucleótidos de 68 pb, que proporciona una nueva combinación para los ribosomas. Puede aumentar la actividad de traducción del gen Gus decenas de veces. Actualmente, existen muchos vectores que añaden secuencias potenciadoras de la traducción ω al extremo 5' de genes extraños.
Ingelbrecht et al. estudiaron las secuencias del extremo 3' de varios genes y descubrieron que la secuencia del extremo 3' del gen de la octopina sintasa puede aumentar la expresión transitoria del gen NPTII en más de 20 veces. Además, las secuencias terminales 3' de diferentes genes tienen diferente eficiencia para mejorar la expresión de genes, como los glóbulos rojos.
2.2 Optimizar la secuencia alrededor del código inicial
Aunque el codón de inicio es universal en el mundo biológico, los genes de diferentes fuentes biológicas tienen sus propias secuencias especiales que rodean el codón de inicio. Por ejemplo, las características típicas de la secuencia periférica del codón de inicio de la planta son AACCAUGC, y la secuencia periférica del codón de inicio de los animales es CACCAUG, que es muy diferente a la de los procariotas. Kosak estudió en detalle los efectos de la mutagénesis dirigida de las bases alrededor del codón de inicio ATG sobre la transcripción y la traducción. Se puede concluir que en eucariotas, la eficiencia de transcripción y traducción es mayor cuando la secuencia alrededor del codón de inicio es ACCATGG, especialmente la A en la posición -3 es crítica para la eficiencia de la traducción. Esta secuencia fue denominada secuencia Kossack por generaciones posteriores y se ha utilizado en la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, existe un gen de quitinasa bacteriana cuya secuencia de codones de inicio original es UUUAUGG. Cuando se modifica a ACCAUGG, su expresión en el tabaco se multiplica por ocho.
2.3 Región codificante del gen de transformación.
Si los genes extraños provienen de procariotas, los niveles de expresión de estos genes en las plantas suelen ser muy bajos debido a diferencias en los mecanismos de expresión. Por ejemplo, el gen de la proteína insecticida de tipo salvaje de Bacillus thuringiensis se expresó en niveles muy bajos en las plantas, y se descubrió que esto se debía a diferencias entre los genes procarióticos y vegetales, lo que resultaba en una estabilidad reducida del ARNm. Perlak y otros de la empresa Monsanto de Estados Unidos modificaron el gen de la proteína insecticida sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína venenosa. Seleccionaron los codones preferidos de la planta, aumentaron el contenido de GC y eliminaron los efectos de la secuencia original sobre la estabilidad del ARNm. elemento sexual. Como resultado, el nivel de expresión de la proteína venenosa en las plantas transgénicas aumentó de 30 a 100 veces, logrando evidentes efectos antiinsectos.
3 Elimina los efectos de posición
Cuando un gen extraño se trasplanta a una planta receptora, sus niveles de expresión en diferentes plantas transgénicas suelen variar mucho. Esto se debe principalmente a los diferentes sitios de inserción de genes extraños en el genoma de las plantas receptoras. Éste es el llamado "efecto de posición". Para eliminar los efectos de posición e integrar genes extraños en la región transcripcionalmente activa del genoma de la planta, las estrategias actuales de construcción de vectores de expresión generalmente consideran la aplicación de regiones de unión a matrices nucleares y tecnología de integración específica de sitio.
La región de asociación matricial (MAR) es una secuencia de ADN presente en la cromatina de las células eucariotas que se une específicamente a la matriz nuclear. Generalmente se cree que la secuencia MAR está ubicada en el límite de la estructura circular del ADN transcrito activamente y su función es crear un efecto de segmentación para que cada unidad de transcripción permanezca relativamente independiente y no se vea afectada por la cromatina circundante. Estudios relevantes han demostrado que las secuencias MAR están ubicadas en los límites de las estructuras circulares de ADN transcripcionalmente activas. Colocar MAR en ambos lados del gen objetivo y construir un vector de expresión vegetal que contenga la estructura MAR-gen-MAR para la transformación genética puede mejorar significativamente el nivel de expresión del gen objetivo, reducir la diferencia en el nivel de expresión del gen objetivo entre diferentes plantas transgénicas y reducir los efectos de posición. Por ejemplo, Allen et al. estudiaron los efectos de MAR heterólogo (de levadura) y MAR homólogo (de tabaco) sobre la expresión del gen Gus en el tabaco. Se encontró que el nivel de expresión del transgén aumentaba 65.438 ± 0,2 veces en la levadura y 60 veces en el propio tabaco. También se puede lograr el mismo efecto utilizando MAR derivado del gen de la lisozima de pollo.
Otro enfoque factible es utilizar tecnología de integración orientada al sitio. El principio fundamental de esta tecnología es que cuando el vector de transformación contiene un segmento de ADN que es homólogo al cromosoma del huésped, el gen extraño puede integrarse en una parte específica del cromosoma mediante recombinación homóloga. En la operación real, primero se debe aislar el fragmento de ADN de la región transcripcionalmente activa del cromosoma y luego se debe construir el vector de expresión de la planta. En la manipulación genética de microorganismos, la integración dirigida al sitio mediante recombinación homóloga se ha convertido en una tecnología de rutina. La integración dirigida al sitio de genes extraños ha tenido éxito en animales, pero en plantas, hay pocos informes exitosos de transformación nuclear, excepto en los vectores de expresión de cloroplastos.
4. Construcción del vector de expresión del cloroplasto
Para superar los problemas de baja eficiencia de expresión de genes exógenos, efecto de posición e inseguridad causados por la difusión de genes nucleares con el polen, muchos En los últimos años han surgido métodos de transformación genética. Una nueva tecnología de transformación genética, la transformación de cloroplastos, ha sido cada vez más reconocida y valorada por sus ventajas y perspectivas de desarrollo. Hasta ahora, se ha logrado la transformación de los cloroplastos en cinco plantas: tabaco, arroz, Arabidopsis, patata y colza (publicado por Hou Bingkai et al.)
En la actualidad, se han logrado las secuencias completas de los genomas de los cloroplastos de muchas plantas. Determinado: sienta las bases para la integración selectiva de genes extraños en el genoma del cloroplasto mediante el mecanismo de recombinación homóloga. Los vectores de expresión de cloroplastos construidos hasta ahora son básicamente vectores de integración específicos de sitio. El vector de expresión de cloroplasto construido es básicamente un vector de caso específico de sitio. Cuando se construye un vector de expresión de cloroplasto, normalmente se conecta una secuencia de ADN de cloroplasto a ambos lados del casete de expresión de gen exógeno. Se denominan fragmentos de recombinación homóloga o fragmentos de direccionamiento. Cuando el vector se introduce en el cloroplasto, es posible integrar el gen extraño en un sitio específico del genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga entre estos dos fragmentos y el mismo fragmento en el genoma del cloroplasto. En la transformación de cloroplastos para la mejora de cultivos, se requiere que la inserción de genes extraños después de la recombinación homóloga no cause la pérdida de la secuencia original del gen del cloroplasto. sin destruir la función del gen original en el punto de inserción. Para cumplir con este requisito, el trabajo existente ha seleccionado dos genes adyacentes como fragmentos de recombinación homóloga, como rbcl/accd, 16 strnv/rpsl2rps7, psba/trnk, rps7/ndhb. Cuando se produce una recombinación homóloga, el gen extraño se inserta en la región espaciadora de dos genes adyacentes en un punto fijo. La función del gen original no se ve afectada. Recientemente, Daniel et al. construyeron un vector universal utilizando los genes del cloroplasto del tabaco trnA y trnI como fragmentos de recombinación homólogos. Dado que las secuencias de ADN de trnA y trnI están altamente conservadas en las plantas superiores, los autores creen que este vector puede usarse para la transformación de cloroplastos en muchas plantas diferentes. Si se confirma la versatilidad de este vector, este trabajo proporcionará sin duda una buena idea para construir un nuevo vector de expresión de cloroplastos conveniente y práctico.
Debido al alto número de copias del genoma del cloroplasto, los genes extraños que están integrados de manera específica en el genoma del cloroplasto a menudo se pueden expresar de manera eficiente. Por ejemplo, McBride et al. transfirieron por primera vez el gen de la toxina Bt CryIA(c) a los cloroplastos del tabaco. El nivel de expresión de la proteína de la toxina Bt alcanza entre el 3% y el 5% de la proteína total de la hoja, mientras que la proteína nuclear habitual. La tecnología de transformación sólo puede alcanzar entre el 0,001% y el 0,6%. Recientemente, Kota et al. transfirieron el gen de la proteína Bt Cry2Aa2 a los cloroplastos del tabaco y descubrieron que el nivel de expresión de proteínas tóxicas en las hojas de tabaco es muy alto, representando del 2% al 3% de las proteínas solubles, que es de 20 a 30 veces mayor que el gen de la proteína Bt Cry2Aa2 en los cloroplastos del tabaco. Transformación nuclear. El tabaco modificado genéticamente no sólo repele los insectos sensibles sino que también mata a los que son muy resistentes. Staub et al. informaron recientemente sobre la transferencia de genes de la hormona del crecimiento humano a los cloroplastos del tabaco. El nivel de expresión de los cloroplastos en las hojas llega al 7% de la proteína total, que es 300 veces mayor que el de la transformación nuclear. Estos experimentos demuestran plenamente que la construcción y transformación de vectores de expresión de cloroplastos es una de las formas importantes de lograr la expresión eficiente de genes extraños.
Aplicación de señales de posicionamiento
El objetivo principal de la estrategia de optimización de vectores anterior es mejorar la eficiencia de transcripción y traducción de genes extraños. Sin embargo, si las proteínas extrañas expresadas en alto nivel pueden existir de manera estable en las células vegetales y en qué cantidad se acumulan es otra cuestión importante que debe considerarse en la transformación genética de las plantas.
En los últimos años se ha descubierto que si ciertos genes extraños se conectan a secuencias de señales de posicionamiento apropiadas, las proteínas extrañas pueden ser transportadas a partes específicas de la célula, como cloroplastos, retículo endoplásmico, vacuolas, etc. . , puede mejorar significativamente la estabilidad y acumulación de proteínas extrañas. Esto se debe a que regiones específicas, como el retículo endoplásmico, proporcionan un entorno interno relativamente estable para algunas proteínas extrañas, lo que previene eficazmente la degradación de proteínas extrañas. Por ejemplo, Wong et al. vincularon la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad rbcS de Arabidopsis thaliana con genes de proteínas insecticidas y descubrieron que las proteínas insecticidas pueden acumularse específicamente en los cloroplastos del tabaco transgénico, y la acumulación total de proteínas extrañas es un 10% mayor que la de la subunidad rbcS de Arabidopsis thaliana. la del control. Recientemente, He Song vinculó la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad rbcS a genes relacionados con la síntesis de PHB en un intento de acumular productos de expresión génica en los plastidios de semillas de colza transgénicas.
Además, Vandelt et al. y Schouten et al. vincularon la secuencia de localización del retículo endoplásmico (secuencia codificante del tetrapéptido KDEL) al gen de la proteína extraña y descubrieron que el contenido de proteína extraña en plantas transgénicas aumentaba significativamente. Obviamente, las señales de localización tienen un efecto positivo en la promoción de la acumulación de proteínas, pero aún está por determinar si la misma señal de localización se aplica a todas las proteínas.
Aplicación del intrón 6 para mejorar la expresión genética
El efecto de los intrones para mejorar la expresión genética fue descubierto por primera vez por Callis et al. en el maíz transgénico. El gen de la alcohol deshidrogenasa (The first. El intrón (intrón 1) de Adhl mejoró significativamente la expresión del gen extraño, y otros intrones del gen (como el intrón 8 y el intrón 9) también mejoraron la expresión de genes extraños. Más tarde, Vasil et al también descubrieron que el primer intrón del gen de la fructosa sintasa del maíz puede aumentar el nivel de expresión de CAT en 10 veces, y el tercer intrón del gen de actina del arroz también puede aumentar el nivel de expresión del gen informador en 2. a 6 veces. Hasta ahora, el mecanismo por el cual los intrones mejoran la expresión génica no está claro, pero en general se cree que la presencia de intrones puede mejorar la eficiencia del procesamiento y la estabilidad del ARNm. Muchos estudios realizados por Tanaka et al. han demostrado que el efecto de mejora de los intrones sobre la expresión genética ocurre principalmente en hojas monocotiledóneas.
Debido a que los intrones pueden mejorar la expresión génica, Mcelroy et al. mantuvieron deliberadamente el primer intrón del gen de actina de arroz aguas abajo del promotor del gen al construir un vector de expresión monocotiledónea. De manera similar, Christensen et al. colocaron el primer intrón del gen de la ubiquitina del maíz aguas abajo del promotor al construir un vector para mejorar la expresión de genes extraños en monocotiledóneas. Sin embargo, algunos estudios han señalado que la promoción de la expresión génica por intrones específicos depende de muchos factores, como la fuerza del promotor, el tipo de célula, la secuencia del gen diana, etc. , a veces incluso dependiendo de la ubicación del intrón en el vector. Por ejemplo, el intrón 9 del gen Adhl del maíz está situado en el extremo 5' del gen Gus. Bajo el control del promotor CaMV35S, la expresión del gen Gus no aumenta cuando el intrón está situado en el extremo 3; del gen Gus, la expresión del gen Gus no aumenta bajo el control del promotor CaMV35S. Bajo control, el nivel de expresión del gen Gus aumentó aproximadamente 3 veces. Se puede ver que el mecanismo de los intrones en la expresión génica puede ser muy complejo. Cómo utilizar los intrones para construir vectores de expresión vegetales eficientes aún carece de un modelo fijo y merece una mayor exploración.
7 Estrategia Multigénica
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios de transformación genética implican la transferencia de un único gen extraño a la planta receptora. Sin embargo, a veces no se pueden obtener plantas transgénicas ideales debido a una intensidad de expresión insuficiente de un solo gen o de un solo mecanismo de acción. Si dos o más genes con efectos sinérgicos se transforman en plantas al mismo tiempo, se obtendrán mejores resultados que mediante la transformación de un solo gen. Esta estrategia se ha utilizado para crear plantas genéticamente modificadas que sean resistentes a plagas y enfermedades. Por ejemplo, dependiendo del espectro de resistencia a los insectos y del mecanismo de acción de los genes resistentes a los insectos, se pueden seleccionar dos genes con funciones complementarias para la construcción del vector, y los dos genes resistentes a los insectos se pueden transferir simultáneamente a una planta en un determinado manera. Wang Wei y otros transformaron simultáneamente genes de lectinas y genes inhibidores de proteasa en algodón y obtuvieron plantas transformadas que contenían genes bivalentes resistentes a insectos. Patton y otros transfirieron simultáneamente genes de la proteína insecticida Bt y genes de la toxina del escorpión al tabaco. Su resistencia a los insectos y su capacidad para evitar que las plagas desarrollen resistencia se han mejorado enormemente (patentado). En términos de resistencia a las enfermedades, Lan Haiyan y otros en nuestro laboratorio construyeron un vector de expresión vegetal bivalente que contenía el gen de la β-1,3-glucanasa y el gen de la quitinasa y lo introdujeron en la colza y el algodón. Los resultados mostraron que las plantas transgénicas tenían una evidente resistencia a las enfermedades. Recientemente, Feng Daorong, Li Baojian y otros vincularon dos o tres genes antifúngicos con el gen hpt. Los dos genes resistentes a los insectos y el gen bar se conectaron a otro vector y se introdujeron en las plantas de arroz mediante una pistola genética. Los resultados muestran que el 70% de las plantas de la generación R contienen todos los genes extraños introducidos (6-7), y los genes extraños introducidos tienden a integrarse en uno o dos sitios del genoma.
Generalmente, los fragmentos de ADN extraño de más de 25 kb no pueden introducirse en las células vegetales mediante transformación convencional. Algunos genes funcionalmente relacionados, como los genes de rasgos cuantitativos y los genes de resistencia a enfermedades en las plantas, existen principalmente en forma de "grupos de genes".
Si algunos fragmentos grandes de ADN de más de 100 kb, como grupos de genes naturales en los cromosomas de las plantas o una serie de genes extraños no relacionados, se introducen en el mismo sitio del genoma de la planta, será posible tener rasgos excelentes controlados por múltiples genes o para producir resistencia a insectos y enfermedades de amplio espectro también brindará a las células receptoras una nueva vía metabólica para producir nuevas biomoléculas. No solo eso, la inserción sincrónica de grandes grupos de genes o grupos de genes también puede superar en cierta medida el efecto de posición causado por los transgenes y reducir la aparición de fenómenos indeseables como el silenciamiento de genes. Recientemente, Hamilton en Estados Unidos y Liu Yaoguang en China han desarrollado una nueva generación de sistemas vectoriales, a saber, BIBAC y TAC, que pueden clonar grandes fragmentos de ADN y transformar directamente plantas con la ayuda de Agrobacterium. Estos dos vectores no sólo pueden acelerar la clonación basada en mapas genéticos, sino que también tienen un valor de aplicación potencial para la mejora de variedades bajo control de múltiples genes. En la actualidad, acaba de comenzar la investigación sobre la aplicación de los vectores BIBAC y TAC en la transformación multigénica.
8 Utilización y eliminación de genes marcadores de detección
La selección de genes marcadores se refiere a marcadores que permiten seleccionar células (o individuos) transformadas de muchas células no transformadas durante la transformación genética. Gene. Generalmente permiten que las células transgénicas produzcan productos que son resistentes a un determinado agente de selección, de modo que las células transgénicas pueden crecer normalmente en el medio con esta selección, mientras que las células no transgénicas muestran resistencia a este agente de selección debido a la falta de resistencia. de sensibilidad, incapaz de crecer, desarrollarse y diferenciarse. Al construir el vector, el gen marcador de detección se conecta al gen objetivo y cada gen tiene su propia secuencia reguladora genética (como promotor, terminador, etc.). Actualmente, existen dos tipos principales de genes marcadores de detección de uso común: genes de enzimas de resistencia a antibióticos y genes de enzimas de resistencia a herbicidas. Los primeros pueden desarrollar resistencia a ciertos antibióticos y los segundos pueden desarrollar resistencia a los herbicidas. Los genes de enzimas de resistencia a los antibióticos más utilizados incluyen el gen NPTII (fosfotransferasa productora de neomicina, resistencia a la kanamicina), el gen HPT (fosfotransferasa productora de higromicina, resistencia a la higromicina) y el gen Gent (resistencia a la gentamicina (micina), etc. Los genes de resistencia a herbicidas comúnmente utilizados incluyen el gen EPSP (produce 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, resistencia al glifosato), el gen GOX (produce glifosato oxidasa, degrada el glifosato) y el gen bar (produce PPT acetiltransferasa, anti-Biala).
Vale la pena destacar lo anterior, 1, 2, 3, 5 y 6, especialmente el 5, porque es necesario secretarlo fuera de la célula. El vector principal podría ser PB I121 y luego se puede cambiar el genotipo.
El siguiente paso es el de clonación, que es relativamente sencillo.
1 Primero obtenga el sitio de restricción del gen diana y conéctelo al vector modificado.
2. Transferir el plásmido a E. coli DH5a para su amplificación.
3. Transferir el plásmido amplificado a células vegetales para su expresión.
Recoger el medio de cultivo extracelular de raíz y detectar si hay expresión y secreción de la proteína.
En cuanto a los pasos para transformar el vector, déjame explicarte brevemente para poder responder a la pregunta. Después de todo, si realmente construyes una buena compañía, puedes iniciar tu propia empresa.