¿Cuáles son las ventajas de utilizar la selección de tomate asistida por marcadores moleculares?
Para mejorar la eficiencia de la selección, los investigadores combinan la biotecnología con la reproducción convencional. Algunos genes importantes de calidad del tomate, como los genes de resistencia a enfermedades Tm-2, I, cf2, cf4, cf5, cf9, Cf-ECP3, Mi, Asc, Fr1, Py-1, Pto, Sw-5, Ve, etc. , así como Y, R, B. MB y otros genes relacionados con la vía de síntesis de carotenoides (Tabla 24-4), genes relacionados con la fotosíntesis del tomate, respiración, azúcar, grasas, proteínas, síntesis y descomposición de ácidos nucleicos, etc. Se han obtenido marcadores moleculares muy ligados a ellos. Con la ayuda de marcadores moleculares, los mejoradores pueden seleccionar eficazmente plantas que contienen genes objetivo en la etapa de plántula y eliminar una gran cantidad de plantas que contienen genes no objetivo, mejorando así la eficiencia y precisión de la selección, acortando el tiempo de identificación y acelerando el proceso de mejoramiento. Con la publicación y la mejora continua del mapa genético molecular RFLP del tomate de alta densidad de Tanksley (1992) y el establecimiento de la tecnología de análisis QTL, los mejoradores pueden manipular y controlar loci de rasgos cuantitativos (QTL) como el rendimiento, la calidad, la resistencia a enfermedades y el estrés. Los deseos se hacen realidad gradualmente. Con la ayuda de los métodos de análisis de QTL, se han identificado y aislado QTL beneficiosos en una gran cantidad de germoplasma silvestre y domesticado. La aplicación del método de análisis AB-QTL (QTL retrocruzado avanzado) también realiza la combinación orgánica del análisis de QTL y la selección de variedades.
Tabla 24-4 Genes de resistencia a plagas y enfermedades del tomate mapeados mediante marcadores moleculares
Cuadro 24-4 Genes de resistencia a plagas y enfermedades del tomate mapeados por marcadores moleculares (continuación)-1
Según los resultados de la investigación de QTL, los mejoradores pueden utilizar marcadores moleculares estrechamente vinculados a QTL para seleccionar eficientemente el QTL objetivo, logrando un gran cambio desde la selección genética convencional de fenotipos a la selección directa de genes objetivo. Por lo tanto, la tecnología de análisis QTL ha recibido gran atención desde su aparición y la gente está convencida de que la aplicación de los resultados de la investigación en este campo traerá grandes cambios al mejoramiento de cultivos.
Tipos de marcadores moleculares y sus aplicaciones en tomate: Los marcadores moleculares basados en ADN están ampliamente distribuidos en el genoma y tienen alto polimorfismo, gran cantidad de información, buena repetibilidad y estabilidad, y altas ventajas de análisis. Se utilizan ampliamente en todos los aspectos de la investigación genética del tomate, como el análisis de la diversidad genética, la construcción de mapas genéticos, los marcadores y el posicionamiento de genes de rasgos objetivo (incluidos los rasgos de calidad y los rasgos cuantitativos), la selección asistida por marcadores moleculares y la identificación de la pureza de la variedad. Los marcadores moleculares incluyen principalmente los siguientes tipos:
1. RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción)
Botstein (1980) y otros propusieron por primera vez esta tecnología, y Vallejos y Tanksley utilizaron esta tecnología. Marcadores RFLP que están estrechamente relacionados con los genes R45s, RBCS1, RBCS2, RBCS3, CAB1, CAB2 y CAB3 del tomate. Posteriormente Lincoln (1987), Pishesky (1987, 65438+CAB8, 1989), Schaff (1990), Rotman (1991). Se estudiaron los marcadores de HSF8, HSF24, HSF30, ACC1, ACC2, ACC3, ACC4 y ACC1 y se obtuvieron los marcadores RFLP correspondientes. En 1989, Young y Tanksley utilizaron marcadores RFLP para analizar fragmentos cromosómicos de especies silvestres que portaban Tm-2 o Tm-2 en hierba carmín. Seleccionaron marcadores RFLP que flanquean el locus Tm-2 y analizaron 65.438+02 Tm-2 y cepas Tm-2 de diferentes fuentes de reproducción. Se descubrió que el fragmento de gen introgresado más grande cubre casi todo el brazo corto del cromosoma 9, con una distancia en el mapa de hasta 565.438+0 cm, y el más corto mide solo unos 4 cM.
Desde 65438 hasta 0992, Tanksley desarrolló casi 900 marcadores RFLP basados en poblaciones de progenie híbrida de tomates comunes y tomates Panali, y estableció un mapa genético molecular RFLP de tomates de alta densidad. Hasta ahora, la Universidad de Cornell en Estados Unidos ha publicado sólo 2330 marcadores RFLP en cultivos de hortalizas solanáceas.
2.RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente)
Williams et al. (1990) inventaron la tecnología RAPD basada en el principio de la PCR. En tomate, Wade (1993) et al. obtuvieron 100 marcadores RAPD específicos del cromosoma 6 de una línea de introgresión de tomate común que contenía tomate Panali, 13 de los cuales estaban ubicados en los marcadores morfológicos yv (virus amarillo) y tl (sin tiamina). Vander (1992), Egashira (2000) y otros utilizaron el método RAPD para realizar análisis de conglomerados en tomates comunes y varios tomates silvestres, y los resultados proporcionaron buena evidencia para la clasificación de los tomates. Luo (1995), Wilander (1998), Li Jihong (1999), Pu (2000), Gao Lan (2001), (2002), etc. Luego se analizaron los recursos o variedades de germoplasma de tomate para detectar RAPD. Yaghoobi (1998) et al. utilizaron la tecnología RAPD para marcar el gen de resistencia a nematodos Mi-3 recientemente descubierto. Entre 520 cebadores aleatorios, se encontraron 2 marcadores vinculados. Entre ellos, NR14 está estrechamente relacionado con el marcador RFLP TG180, lo que hace que Mi-3 esté ubicado en el brazo corto del cromosoma 12. Bi et al. utilizaron 288 cebadores aleatorios de 10 o 12 bases para marcar genes de resistencia al marchitamiento bacteriano y encontraron 4 marcadores vinculados, 2 de los cuales estaban vinculados a un gen de alta eficiencia. Además, Ohomori (1995), Motoyoshi (1996), Pillen (1996), Dax E. (1998), Tian Miaoying (2000) y otros han desarrollado sucesivamente genes de resistencia al virus del mosaico del tabaco del tomate Tm-2 y Tm-2.
3. Repeticiones de secuencias simples
Broun (1996) utilizó secuencias repetidas de GATA y GACA para dibujar un mapa de tomate. Los resultados mostraron que las secuencias repetidas no estaban distribuidas aleatoriamente en el genoma del tomate sino que estaban ubicadas cerca del centrómero. Los autores creen que estas dos secuencias repetidas pueden utilizarse para detectar polimorfismos en variedades. Kaemmer (1995) utilizó (GACA)4 como sonda para el análisis RFLP y los resultados mostraron que casi todas las variedades producirán una huella dactilar única y estable, por lo que puede utilizarse ampliamente para la identificación de variedades. Luan (1999) también obtuvo resultados similares y estableció marcadores SSR para nueve variedades de tomate. Actualmente, existen 734 marcadores SSR en cultivos de Solanáceas publicados por la Universidad de Cornell en Estados Unidos.
4. Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificado
Thomas C.M. (1995) obtuvo 42.000 bandas de AFLP de la población F2 de hibridación interespecífica entre tomate y tomate silvestre. M2, M3) aislados del gen Cf-9 * * * Estos tres marcadores están ubicados en la región 0,4cM en ambos lados del gen Cf-9. Usando estos marcadores para analizar el plásmido que contiene el gen Cf-9, se encontró que los marcadores M1 y M2 estaban ubicados a 15,5 kb alrededor del gen Cf-9. Recientemente, se descubrieron algunos nuevos genes de resistencia al moho de las hojas débilmente resistentes cerca de los genes Cf-4 y Cf-9 mediante AFLP o tecnología de etiquetado de transposones (Takken et al., 1999).
5. Región de amplificación característica de la secuencia
Williamson V M (1994) obtuvo el marcador SCAR del gen de resistencia al nematodo agallador del tomate. Mi, Chague v (1996) obtuvo la resistencia al virus del tizón foliar del tomate. Marcador SCAR del gen Sw-5.
6.*** Marcadores SCAR dominantes
El grupo de investigación de tomate fresco del Instituto de Hortalizas y Flores de la Academia China de Ciencias Agrícolas, estableció un marcador SCAR dominante utilizando el principio de Marcadores SCAR y tecnología PCR multicebador La tecnología CODominant-SCAR, a partir de la obtención de marcadores SCAR dominantes consistentes con los genotipos paterno y materno, añade los cebadores específicos de ambos padres al mismo sistema de reacción PCR para obtener un método que can Un método de marcador para identificar simultáneamente los genotipos del progenitor masculino, del progenitor femenino y sus heterocigotos.
Este marcador es un marcador molecular muy estable con buena repetibilidad, rapidez, simplicidad y bajo costo de aplicación, y es adecuado para el análisis de una gran cantidad de muestras. Tiene un gran valor de aplicación práctica para la identificación de la pureza de semillas de híbridos de cultivos, la aprobación de nuevas variedades y la protección de la propiedad intelectual de variedades.
7. Sitio de etiqueta de secuencia
STS es un fragmento específico con una longitud de varios cientos de pb. Se diseña un par de cebadores específicos en función de la secuencia en ambos extremos de una única copia. del fragmento de ADN para amplificarlo. Se produce aumentando el ADN genómico. Debido al uso de longitudes de cebadores de PCR convencionales, los resultados de la amplificación son estables y fiables. Las etiquetas RFLP se pueden convertir en STS secuenciando ambos extremos. Los STS suelen aparecer sólo una vez en el genoma y pueden definir sitios específicos en el genoma (Olson et al., 1989). El mapeo físico de STS se puede lograr mediante PCR o hibridación, lo que hace que el mapeo físico sea conveniente y rápido. STS es de gran importancia en la investigación genómica porque puede servir como punto isomórfico para comparar mapas genéticos y físicos. Posteriormente, K.MeKsem(2001+0) transformó 10 marcadores AFLP y obtuvo 6 marcadores STS.
8. Cortar y amplificar sitios de marcadores de secuencia polimórfica
CAPS, como SCAR, STS y otros marcadores, también es un método para convertir RFLP, AFLP, RAPD y otros marcadores. Después de la amplificación, la banda de electroforesis del producto del cebador específico marcado con CAPS no muestra polimorfismo, pero después de la digestión con enzimas de restricción, el producto de la PCR puede visualizarse mediante detección por electroforesis. El marcador CAPS revela información sobre variaciones en los sitios de restricción en la secuencia de ADN de un producto de amplificación por PCR específico y se expresa como un marcador dominante. Se obtuvieron marcadores CAPS para resistencia a los genes del nematodo Mi, TMV Tm2, moho de la hoja cf5, cf9, mildiú polvoriento Fr1 y mancha bacteriana de la hoja Pto en tomate. Actualmente, existen 84 marcadores CAPS publicados por la Universidad de Cornell en cultivos de Solanáceas.
9. El corte múltiple y la amplificación de sitios marcadores de secuencia polimórfica
RFLP y AFLP tienen las desventajas de una operación compleja, tiempo prolongado, pasos radiactivos y alto costo. Por lo tanto, para reducir costos y mejorar la eficiencia, algunos marcadores RFLP, marcadores AFLP y marcadores COS se convierten en marcadores CAPS en la construcción de mapas moleculares, reproducción molecular y análisis de QTL. Durante el proceso de conversión de marcadores RFLP y COS en marcadores CAPS, se descubrió que algunos marcadores CAPS comparten la misma enzima de restricción. Teniendo en cuenta las ventajas de la PCR múltiple al amplificar las secuencias correspondientes simultáneamente utilizando diferentes pares de cebadores en la misma reacción de amplificación, y el hecho de que múltiples marcadores CAPS comparten la misma enzima de restricción, la CAPS múltiple se estableció basándose en los principios de la PCR múltiple y la CAPS. La tecnología, que combina las ventajas de la PCR múltiple y CAPS, puede utilizarse para la identificación genética rápida y el mejoramiento molecular del tomate (Wang, Du et al., 2003). En la actualidad, este método se ha aplicado con éxito al análisis de genes de resistencia al moho de la hoja del tomate y genes de resistencia al nematodo agallador.
10. Polimorfismo de un solo nucleótido
Al secuenciarlo y luego compararlo con la secuencia de nucleótidos de la región correspondiente en el genoma relevante, se pueden detectar diferencias en la secuencia de nucleótidos, algunas de las cuales. Son causados por diferencias en nucleótidos individuales, son polimorfismos genéticos conocidos como marcadores SNP. K. Meksem et al (2001) convirtieron con éxito marcadores AFLP en tomate en marcadores SNP. Los marcadores SNP son extremadamente abundantes, cubren todo el genoma y tienen amplias perspectivas de aplicación.
En resumen, la tecnología de marcadores moleculares se está desarrollando rápidamente. A medida que se desarrolle la biotecnología, se desarrollarán más tecnologías. La combinación de la tecnología de selección asistida por marcadores moleculares con el mejoramiento convencional de tomates puede mejorar la precisión de la selección y la eficiencia de los rasgos objetivo, acelerando así el proceso de mejoramiento del tomate. Con la implementación del Proyecto Genoma del Tomate [Proyecto Genoma del Tomate (# 9872617), (http://www.nsf.gov/bio/DBI/DBI_PGR.htm)] y el desarrollo y mejora continua de la tecnología de chips genéticos, be La construcción del mapa de enlace saturado del tomate proporciona una gran cantidad de información de datos de ADN y se hereda de una gran cantidad de individuos. Utilizando la información de la secuencia del genoma del tomate, las secuencias de ADN se pueden comparar y analizar directamente para revelar polimorfismos a nivel de un solo nucleótido entre individuos, desarrollando así marcadores SNP extremadamente ricos que cubren todo el genoma.
Mediante el uso de la tecnología de chips genéticos, todos los marcadores moleculares basados en secuencias de ADN (como RFLP, RAPD, CAPS, STS, SNP, etc.), sondas genéticas clonadas, EST y miles de otras secuencias de ADN se pueden fijar en un solo chip. Siempre que se hibride el ADN de las cepas individuales de cada población, se puede identificar una gran cantidad de cepas individuales de forma rápida, precisa y con una alta capacidad de transmisión con la ayuda de programas de análisis automáticos y sistemas de gestión de la información. La aplicación de la tecnología de chips al análisis genético de materiales de mejoramiento de tomates contribuirá al mapeo y clonación precisos de genes y QTL de alta calidad, y también ayudará a mejorar aún más la tecnología moderna de mejoramiento de variedades de tomate y la tecnología y los métodos de mejoramiento asistidos molecularmente.