¿Cuál es el valor de detección de la luciferasa para calcular su actividad?
fluoresceína + ATP → adenilato de fluoresceína) + PPi
adenilato de fluoresceína + O2 → oxígeno Fluoresceína + AMP + luz
Esta reacción ahorra mucho energía y casi toda la energía aportada a la reacción se convierte en luz. A diferencia de las lámparas incandescentes utilizadas por los humanos, sólo más del 10% de la energía se convierte en luz y el resto se convierte en calor y se desperdicia.
La luciferina o luciferasa no es una molécula específica, sino un término general para todos los sustratos que pueden producir fluorescencia y sus correspondientes enzimas, aunque son diferentes. Diferentes organismos capaces de controlar la luminiscencia utilizan diferentes enzimas luciferasa para catalizar diferentes reacciones luminiscentes. Los organismos luminiscentes más conocidos son las luciérnagas, y las diferentes luciferasas que utilizan son diferentes a las de otros organismos luminiscentes, como las setas ostra (Pleurotus ostreatus, Omphalotus olearius) o muchos organismos marinos. En las luciérnagas, el oxígeno necesario para la reacción de emisión de luz proviene de un tubo llamado tráquea abdominal. Algunos organismos, como los insectos de reverencia, contienen múltiples enzimas luciferasa diferentes que pueden catalizar el mismo sustrato de luciferasa para emitir diferentes colores de fluorescencia. Hay más de 2.000 especies de luciérnagas. Sin embargo, hay muchos otros insectos en Coccinelloidea (incluidas luciérnagas, chinches e insectos relacionados), por lo que sus luciferasas son muy útiles para la sistemática molecular. Actualmente, la luciferasa más estudiada es la luciérnaga norteamericana (Photinus pyralis) de la familia Photinini.
Luciferasa
También conocida como luminasa, es el nombre general del sistema enzimático que cataliza la bioluminiscencia. Es un componente polimérico que emite luz en extractos de agua fría de sustancias ligeras en oxígeno. Una vez consumido el sustrato luciferina, se vuelve inestable al calor. Los más estudiados actualmente son las luciérnagas y las bacterias luminiscentes de los cristales de luciferina. Son oxigenasas y no contienen metales ni coenzimas. Para emitir luz, algunas enzimas deben utilizar ATP como cofactor. Otros no lo hacen. Se sabe que el mecanismo de emisión de luz de las luciérnagas varía mucho de una especie a otra. La luciferasa es muy específica y normalmente sólo actúa sobre las enzimas luciferasa de especies relacionadas. Por supuesto, las luciérnagas y las enzimas de las luciérnagas no pueden reemplazarse entre sí para provocar la emisión de luz. La luciferasa de luciérnaga es bastante estable en estado seco y puede almacenarse.
Ensayo indicador de luciferasa dual: tecnología avanzada de ensayo de gen indicador * * * que combina luciferasa celenterada de luciérnaga y marina.
Cuando se utiliza luciferasa de luciérnaga para cuantificar genes. Al expresarse, se introduce un segundo gen indicador. A menudo se utiliza para reducir el factor de variabilidad en el experimento. Sin embargo, los reporteros * * tradicionales (por ejemplo, CAT, β-Gal, GUS) son inconvenientes debido a sus diferentes químicas de prueba, requisitos de procesamiento y propiedades de detección. Promega proporciona tecnología avanzada de gen informador dual. Combinando la prueba de luciferasa de luciérnaga y la prueba de luciferasa de celenterado marino, el sistema de detección de gen indicador de luciferasa dual, combinado con el sistema de vector pRL, expresa el segundo gen indicador de luciferasa de celenterado marino y realiza fluorescencia dual en un solo tubo. La detección del gen indicador de Suzyme es Rápido, sensible y sencillo. El sistema también proporciona lisados de PLB para lisar células de mamíferos cultivadas en placas multipocillo sin la necesidad de manipular muestras individuales. Para los investigadores que utilizan vectores de genes indicadores de luciferasa de luciérnaga...
Introducción
Los genes indicadores duales se utilizan para la detección de correlación o proporción en sistemas experimentales, normalmente se utiliza un gen indicador Sirve como gen indicador interno control para que la detección de otro gen informador sea consistente. Cuando se examina la expresión génica, a menudo se utilizan indicadores duales para transfectar transitoriamente células cultivadas, y el vector con el gen indicador experimental se transfecta con un segundo vector con un gen indicador diferente como control. Normalmente, los genes indicadores experimentales están acoplados a promotores regulados. Estudiar las bases estructurales y fisiológicas de los genes reguladores.
Los cambios relativos en la actividad de expresión del gen informador están relacionados con cambios en la actividad transcripcional del promotor regulador acoplado. Un segundo gen indicador acoplado a un promotor constitutivo proporciona control interno de la actividad transcripcional de modo que el ensayo no se vea perturbado por cambios en las condiciones experimentales.
Con este enfoque, se puede reducir la precisión experimental que se ve afectada por variables internas, como las diferencias en el número y la viabilidad de las células cultivadas y la eficiencia de la transfección y lisis celular.
En los últimos años, la luciferasa de luciérnaga se ha utilizado ampliamente en combinación con reporteros duales de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), β-galactosidasa (β-Gal) o glucuronidasa (GUS). Sin embargo, estas combinaciones de genes indicadores duales debilitan las ventajas de la manipulación de la luciferasa, ya que la prueba y la cuantificación de la luciferasa se pueden realizar en segundos, pero los métodos de prueba CAT, β-Gal y GUS, además, estos indicadores están sujetos a sus límites. sensibilidad y rangos de respuesta lineal, por lo que se debe tener cuidado de no exceder estos rangos, y la viabilidad celular endógena también puede interferir con el uso de dichos reporteros. Muchos tipos de células tienen expresión endógena de β-Gal o GUS, lo que no conduce a una expresión cuantitativa precisa de genes informadores. La actividad desacetilasa intracelular interfiere con los ensayos de actividad CAT. Aunque el pretratamiento a alta temperatura de los lisados celulares (1, 2) reducirá la interferencia de los ensayos endógenos de β-Gal y CAT, estos tratamientos también inactivarán rápidamente la luciferasa. Por lo tanto, en este ensayo de indicador dual, los lisados celulares transfectados con *** deben procesarse en pasos separados.
Un método ideal de indicador dual permitiría al usuario medir simultáneamente dos indicadores en la misma muestra con la velocidad, sensibilidad y rango lineal de la luciferasa de luciérnaga. Esto no es posible con reporteros tradicionales como CAT, β-Gal y GUS debido a sus limitaciones inherentes en la química de la prueba. En cambio, al combinar luciérnaga (Pyraris) y Renilla reniformis, el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (DLR) de Promega cumple con estos requisitos y completa estas pruebas en un solo tubo.
Química de la prueba del reportero de luciferasa dual
Tanto las luciferasas celenteradas de luciérnaga como las marinas tienen excelentes propiedades de prueba para los reporteros bioluminiscentes, pero sus orígenes evolutivos son diferentes y, por lo tanto, tienen diferentes estructuras enzimáticas y requisitos de sustrato diferentes. . Estas diferencias se utilizaron para desarrollar la química de la prueba DLR y diferenciar selectivamente la actividad de estos dos reporteros bioluminiscentes. La luciferasa de luciérnaga es una proteína con una subunidad de 61 kDa. La actividad enzimática se puede utilizar postraduccionalmente como informador genético sin necesidad de modificaciones postraduccionales (3, 4). Emite luz a través de la reacción de oxidación del escarabajo luciferina en presencia de ATP, Mg2+ y O2 (Figura 1). En condiciones de reacción convencionales, cuando se oxida la fluoresceína, la conversión de fluoresceína-AMP como intermedio es muy lenta. Como resultado, la química de la prueba produce una luz "intermitente" que decae rápidamente después de que se mezclan el sustrato y la enzima. El reactivo de prueba patentado que cuantifica la actividad de la luciferasa de luciérnaga mejora la conversión enzimática rápida al agregar coenzima A (CoA) para mejorar la cinética de reacción (5), lo que da como resultado una señal de luminiscencia "parpadeante" continua (Figura 2).
Figura 1 Bioluminiscencia catalizada por luciferasas de luciérnaga y Renilla
La coelenterasa marina es una proteína de 36 kDa purificada a partir de la fuente natural reniforme Renilla (6), contiene un 3% de carbohidratos. Pero al igual que la luciferasa de luciérnaga, su actividad es postraduccional y no requiere modificaciones postraduccionales para servir como reportero genético. Una reacción luminiscente catalizada por la coelenterazina marina, utilizando O2 y coelenterazina (Figura 1). Cuando se utiliza la química de prueba DLR en el experimento, la cinética de la reacción de la coelenterazina marina produce una señal de luminiscencia de centelleo que decae lentamente durante la detección (Figura 2).
En el sistema de prueba DLR, se utilizaron lisados únicos para medir la actividad de la luciferasa paso a paso en luciérnagas y celentéreos marinos. Después de medir la actividad de la luciferasa de luciérnaga (el gen indicador "experimental"), la luminiscencia de la luciérnaga se aniquila rápidamente, mientras que se activa la reacción de luminiscencia de la luciferasa celenterada marina (el gen indicador "de control"). Por lo tanto, el sistema de prueba DLR integra dos sustancias problema para cuantificar rápidamente la expresión de dos genes informadores.
El rango lineal del ensayo de luciferasa de luciérnaga se extiende a 8 órdenes de magnitud de concentración de enzima, y la enzima del gen informador experimental se puede medir ≤1fg (aproximadamente 10 -20 mol) (Figura 3A).
Utilizando un sistema de detección de gen indicador de luciferasa dual, el rango lineal de la luciferasa celenterada marina alcanza 7 órdenes de magnitud de concentración de enzima, con un límite inferior ≤ 10 fg.
Detección de luminiscencia producida por luciferasas de luciérnaga y Renilla utilizando un gen informador de luciferasa dual. Se transfectaron células CHO (1 x 106/placa de cultivo de 60 mm) con pGL3.
Control y ADN del vector pRL SV40. Después de lavar las células con PBS, se añadieron 400 µl de PLB para preparar el lisado. Mezcle 20 µl de lisado de células pequeñas con 100 µl de reactivo de prueba de luciferasa II (LARII) y detecte inmediatamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga con un fluorómetro (trazador de línea delgada). 5438+000 µl detenga y agregue el reactivo Glo TM al tubo del fluorómetro para eliminar el reacción de luciferasa de luciérnaga y simultáneamente activa la reacción de luciferasa de Renilla y detecta la actividad de luciferasa de Renilla inmediatamente (trazo de línea gruesa). Un fluorómetro Turner Designs modelo 20/20 equipado con una computadora para rastrear la emisión de fluorescencia, la prueba se completó dos veces en 65,438 ± 02 segundos.
El método del sistema de detección del gen indicador de luciferasa dual
La señal de luminiscencia de la luciferasa de los dos genes indicadores se puede cuantificar inmediatamente después de la preparación de la solución de lisis, y allí No es necesario transferir la muestra. Dividirla en grupos pequeños ni realizar procesamiento adicional. Debido a que tanto las luciferasas marinas como las de luciérnaga muestran una cinética de reacción de parpadeo, la prueba de indicador de luciferasa dual no requiere un fluorómetro con una jeringa de reactivo.
Por lo general, la prueba DLR tarda unos 30 segundos en completarse, como se muestra en la Figura 4. Al iniciar el ensayo del indicador de luciferasa de luciérnaga, mezcle el producto de escisión con el reactivo de ensayo de luciferasa II (LAR II). Cuando se completa el ensayo de luciferasa de luciérnaga, se aniquila la luminiscencia de luciérnaga y, al mismo tiempo, se activa la luminiscencia de luciferasa celenterada marina, coloque el reactivo stop & Glo TM en el tubo de muestra. En 1 segundo, el reactivo Stop & Glo TM aniquila la señal de luminiscencia de las reacciones de las luciérnagas con títulos superiores a 1,05 (Figura 5), al tiempo que activa la celenterato luciferasa marina.
Figura 3 El rango lineal de la reacción de luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de Renilla. Las luciferasas purificadas de luciérnaga y Renilla se diluyeron en serie en 1x PLB que contenía 1 mg/ml de BSA. Se utilizó un fluorómetro Turner Designs equipado con computadora para detectar la fluorescencia total durante 65,438 ± 00 segundos. Después de los primeros 2 segundos de retraso en la lectura previa, al detectar directamente la reacción de luminiscencia de dos altas concentraciones de luciferasa, agregue un filtro de densidad neutra a la cámara de muestra del fluorómetro. En las reacciones de luciferasa de Renilla que contienen 10 FG y 100 FG, se restó la señal de fondo de la autoluminiscencia de la luciferasa luminal marina. Las actividades luminiscentes de las dos luciferasas se representan frente a sus respectivas concentraciones cambiantes probadas.
Figura 4. Método para realizar un ensayo de luciferasa dual utilizando un fluorómetro manual o un fluorómetro equipado con un muestreador de reactivos. Por ejemplo, si el fluorómetro está equipado con dos muestreadores, el lisado se empaqueta previamente en los tubos del fluorómetro, seguido del reactivo de ensayo de luciferasa II (LAR II), el reactivo Stop & Glo™.
PLB Lysate
El tampón de lisis PLB está especialmente diseñado para lisar eficazmente células de mamíferos cultivadas sin necesidad de raspar las células adherentes ni de ciclos de congelación y descongelación. Aunque el PLB está diseñado para procesos de lisis pasiva, sus fiables efectos de lisis también benefician a los lisados preparados mediante métodos de procesamiento convencionales. Independientemente del método de lisis utilizado, las enzimas indicadoras de celentéreos marinos y de luciérnaga liberadas en lisados de PLB fueron cuantitativas y confiables para células de mamíferos cultivadas (Figura 6). Una clara ventaja de los lisados pasivos es la inhibición de bajos niveles de luminiscencia no enzimática (autoluminiscencia), que es una característica inherente de los celentéreos marinos en soluciones acuosas. Los reactivos comúnmente utilizados para preparar lisados celulares pueden mejorar la autoluminiscencia de los celentéreos marinos, incluido Triton? X-100, ¿la prueba de lisis de cultivos celulares de Promega? (CCLR) y reactivo de escisión del gen informador (RLB), que también puede inhibir significativamente la reacción de luminiscencia de la celenterato luciferasa marina. PLB está diseñado específicamente para maximizar la actividad de la luciferasa y minimizar la autoluminiscencia, lo que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima y la cuantificación de niveles muy bajos de luciferasa celenterada marina.
Además, PLB inhibe la formación de espuma, lo que es muy adecuado para aplicaciones de paso alto y puede usarse en sistemas automatizados para preparar y probar lisados de poblaciones celulares cultivadas en placas multipocillo.
Figura 5 El sistema de prueba del gen indicador de luciferasa dual elimina la luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga y activa la luminiscencia de la luciferasa de Renilla. El lisado de células CHO que contenía * * * pgl 3-control transfectado y ADN del vector pRL SV40 se preparó según el método descrito en la Figura 2. Detecte las actividades de la luciferasa de luciérnaga (gen informador 1) y la luciferasa de Renilla (gen informador 2) en 10 segundos. La eficacia del reactivo Glo TM para aniquilar el gen informador 1 es agregar un volumen igual de reactivo Stop & Glo TM (sin coelenterazina marina, la reacción de la luciferasa de Renilla no se puede activar), la luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se aniquila y no se activa la luciferasa de Renilla para emitir luz. En este experimento, la luminiscencia residual de la reacción de luciferasa de luciérnaga destruida fue inferior al 0,0004% del valor de la reacción no dañada.