¿Cómo preparar hidrolizado de proteína de seda? Cuanto más detallado mejor, ¡muchas gracias!

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales experimentales

1.1.1 Materias primas y auxiliares

Seda, kudzu, baya de goji, ébano Todos fueron comprados en el mercado de Xuzhou. El laboratorio proporcionó sacarosa, proteasa neutra (130 000 u/g) y tripsina (4000 u/g), y la fábrica de productos bioenzimáticos Guangxi Haifa proporcionó papaína (650 000 u/g).

1.1.2 Reactivos principales

Reactivo de formaldehído, ácido sulfúrico concentrado, ácido clorhídrico concentrado, hidróxido de sodio, sulfato de sodio anhidro, cloruro de calcio anhidro, agua con cloro, ftalato de hidrógeno y potasio, rojo de metilo , sulfato de cobre, ácido bórico, extracto de carne, peptona, agar, sal, resinas de intercambio aniónico y catiónico 731 y 723 y agente rápido mixto: una mezcla de 1 volumen de azul de metileno y 2 volúmenes de indicador rojo de metilo.

1.1.3 Equipo principal

Horno de secado eléctrico a temperatura constante, incubadora eléctrica a temperatura constante, triturador multifuncional, centrífuga a gran escala de baja velocidad, balanza de rejilla, agitador magnético, precisión Medidor de pH, balanza electrónica, baño María digital a temperatura constante, esterilizador de vapor a presión portátil, cocina de inducción.

1.2 Método experimental

1.2.1 Flujo del proceso

(1) Flujo del proceso para la preparación de bebidas utilizando solución de acidólisis

Desgomado de seda →Hidrólisis ácida→Desacidificación de resinas de intercambio catiónico→Aminoácidos de fibroína de seda

Medicina herbaria china→Limpieza→Extracción→Filtración gruesa→Mezcla centrífuga→

Sabor, VC, sacarosa, etc.

Llenado→Sellado→Esterilización→Enfriamiento→Evaluación sensorial y pruebas higiénicas→Producto terminado

(2) Flujo del proceso de preparación de bebidas usando solución enzimática

Desgomado de seda→ CaCl2 disuelve la fibroína de seda → hidrólisis enzimática → inactivación de enzimas → elimina CaCl2 → aminoácidos de fibroína de seda

Medicina herbaria china → limpieza → extracción → filtración gruesa → centrifugación → preparación → llenado

Sabor, VC, sacarosa, etc.

→Sellado→esterilización→enfriamiento→evaluación sensorial y pruebas higiénicas→producto terminado

1.2.2 Método de desgomado de la seda

Lavado y secar. La seda final se hirvió (20 min, 30 min, 40 min) en una solución de Na2CO3 (0,4%, 0,5%, 0,6%) para determinar las condiciones óptimas de desgomado.

1.2.3 Método de hidrólisis ácida de la fibroína de seda

Secar la fibroína de seda desgomada para hacer un experimento de un solo factor. Primero, seleccione una acidez de 3 M, una proporción sólido-líquido de 1:50, acidólisis a 111 °C durante 15 horas y mida el contenido de aminoácidos por hora para obtener un rango adecuado de tiempo de acidólisis; luego seleccione un sólido-líquido; relación de 1:50, y el tiempo de acidólisis está dentro del rango determinado anteriormente, acidólisis en diferentes concentraciones como 1,0 M, 1,5 M, 2,0 M, 2,5 M, 3,0 M, 3,5 M, 4,0 M, 4,5 M, 5,0 M. , etc., a 110°C se puede utilizar para seleccionar un rango de concentración de ácido adecuado; finalmente, se seleccionaron la concentración de ácido y el tiempo para que estuvieran dentro del rango apropiado, y se determinó el más adecuado seleccionando diferentes relaciones sólido-líquido de 1. :20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70 y 1:80. La concentración de ácido obtenida, la relación sólido-líquido y el tiempo de acidólisis se seleccionaron entre 3 niveles dentro del rango apropiado para realizar un experimento ortogonal de 3 factores y 3 niveles para descubrir las condiciones óptimas de acidólisis.

1.2.4 Disolución de fibroína de seda en CaCl2

Preparar diferentes concentraciones (30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ,) Solución de CaCl2, mida el efecto de disolución de la fibroína de seda que contiene y descubra la concentración óptima de CaCl2 para disolver la fibroína de seda.

1.2.5 Métodos de investigación del proceso de hidrólisis enzimática (1) Selección de la mejor hidrolasa. El líquido de proteína de seda se hidrolizó enzimáticamente con la dosis óptima de enzima, la temperatura de hidrólisis enzimática, el valor de pH de hidrólisis enzimática y el mismo tiempo de hidrólisis enzimática de las tres proteasas. Se compararon los efectos de la hidrólisis enzimática de las tres enzimas y se seleccionó el efecto de hidrólisis en función. sobre el rendimiento de aminoácidos. Las mejores enzimas. (2) Determinación de las condiciones de hidrólisis enzimática. Con base en la proteasa de fibroína de seda óptima determinada en los experimentos anteriores, se realizaron experimentos ortogonales en tres niveles de concentración de sustrato, valor de pH y temperatura para determinar las condiciones óptimas para la hidrólisis enzimática.

Las concentraciones de sustrato fueron 4%, 5% y 6% respectivamente, los valores de pH fueron 5,0, 5,5 y 6,0 respectivamente y las temperaturas de hidrólisis enzimática fueron 50°C, 55°C y 60°C respectivamente.

1.2.6 Desacidificación de la solución de acidólisis

Utilice una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte tipo 732 para desacidificar la solución de acidólisis. Cuando el efluente reaccione y haga que la ninhidrina se vuelva violeta, deje de cargar la solución. columna, lave la columna de intercambio iónico con agua desionizada hasta que el efluente sea casi neutro y luego use agua con amoníaco 0,5 M para eluir los aminoácidos hasta que la ninhidrina ya no tenga un aspecto púrpura.

1.2.7 Extracción del jugo de hierbas medicinales chinas

Extraiga la medicina herbaria china lavada y el agua purificada en un baño de agua a 90°C durante 1 hora en una proporción de 1:10 a obtener el líquido. Agregar 8 veces la cantidad de agua pura al residuo y extraerlo en un baño de agua a 90°C durante 0,5 horas. Combinar el filtrado y el líquido residual y centrifugarlos con una centrífuga de gran capacidad a baja velocidad para su uso posterior. .

1.2.8 Formulación de bebidas

Diseñar un experimento ortogonal con 3 factores y 3 niveles para seleccionar la fórmula de la bebida. Para calificar las bebidas, es necesario determinar un estándar de calificación basado en el color, el aroma, el sabor y el estado organizativo del producto.

1.2.9 Esterilización de bebidas y pruebas de higiene

Esterilización de bebidas: Esterilice el producto terminado a 90 °C durante 15 min, 20 min y 25 min respectivamente, y luego colóquelo en un horno a 37 °C. C incubadora de baño de agua a temperatura constante para observar su estabilidad, elija el mejor tiempo de esterilización. El número total de bacterias se determinó mediante el método de recuento de colonias en placa.

1.3 Ítems y métodos de prueba

La proteína bruta en la seda se determinó mediante el método micro Kjeldahl. El contenido de nitrógeno amino se midió usando el método potenciométrico de formaldehído.

1.3.1 Prueba del efecto de desacidificación del hidrolizado enzimático de fibroína de seda

Utilice una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte tipo 732, colóquela en una columna de resina con una altura de 40 cm y Φ15, espere a que el efluente haga que la ninhidrina sea púrpura, lo que indica que la resina está saturada y el líquido de aminoácidos fluye. En este momento, deje de cargar la columna, lave la columna de intercambio iónico con agua desionizada hasta que el efluente sea casi neutro y luego use 0,5. Agua con amoniaco para eluir el aminoácido hasta que no quede más. La reacción de color de la ninhidrina indica que se han eliminado todos los aminoácidos.

1.3.2 Detección del efecto de desionización de la resina de intercambio aniónico y catiónico

Pasar la solución de fibroína de seda disuelta en solución de CaCl2 a través de una columna de resina de intercambio catiónico con una altura de columna de 40 cm y Φ15. Ca2+, use una solución de NaOH para detectar si hay Ca2+ en el efluente. Cuando no aparezca un precipitado blanco, pase a través de una resina de intercambio aniónico con una altura de columna de 40 cm y Φ15 para eliminar Cl-. el efluente. Cuando no haya precipitado blanco, Detener la columna cuando aparezca.

2 Resultados y discusión

2.1 Determinación de las condiciones de desgomado de la seda

Los componentes menores de la seda se distribuyen principalmente en sericina para asegurar el contenido de aminoácidos. de calidad fibroína de seda, se debe realizar un desgomado. La fibroína de seda es insoluble en agua, mientras que la sericina es soluble en agua. Aunque la sericina es hidrófila, lleva mucho tiempo separarla de la fibroína de seda en un medio acuoso y requiere un tratamiento a alta temperatura. Por esta razón, se utiliza Na2CO3 como medio de separación. Entre ellos, la tasa de eliminación de sericina (%) = contenido de proteína en el líquido de sericina (g) × 100% de proteína de sericina total (g). Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Diseño experimental ortogonal y resultados del desprendimiento de Na2CO3 de fibroína de seda

Tiempo de tratamiento (min) Concentración (%) Tasa de eliminación de sericina (%)

1 1 (20) 1 (0,4) 48,5

2 1 2 (0,5) 35,7

3 1 3 (0,6) 59,8

4 2 ( 30) 1 60,3

5 2 2 100

6 2 3 100

7 3 (40) 1 73,9

8 3 2 100

9 3 3 100

Como se puede ver en la Tabla 1, hervir en una solución de NaCO3 al 0,5% durante 30 minutos tiene el mejor efecto desgomado. Para evitar que el agua se evapore y afecte la concentración de NaCO3 durante la ebullición, se debe colocar una tapa en el recipiente. La seda se convierte en fibroína de seda después del desgomado y la sericina existe en medio acuoso.

2.2 Experimento de factor único de hidrólisis ácida

Utilice 1 g de fibroína de seda para hidrolizar en H2SO4 3 M, relación sólido-líquido 1:60 y 110 °C. A partir de experimentos se descubrió que la fibroína de seda se puede disolver completamente en H2SO4 durante 3 horas. La medición de la situación de hidrólisis de 4 a 15 horas mostró que el contenido de aminoácidos era mayor de 8 a 10 horas y después de 10 horas cambió poco o incluso comenzó a disminuir.

Utilice fibroína de seda para acidular en una proporción sólido-líquido de 1:60 y 110 °C durante 8 horas para comparar la relación entre diferentes concentraciones de H2SO4 y el contenido de nitrógeno amino. El resultado es la concentración de acidólisis. demasiado bajo o demasiado alto afectará el contenido de aminoácidos. Es mejor controlarlo entre 3M y 4M.

Utilice fibroína de seda para acidólisis en H2SO4 3 M a 110 °C durante 8 horas. Mida el efecto de la relación sólido-líquido sobre la acidólisis, ya que la fibroína de seda solo se puede remojar con una relación sólido-líquido de al menos. 1:20, esta es la proporción mínima sólido-líquido. Los resultados mostraron que el efecto de hidrólisis era mejor cuando la relación sólido-líquido estaba entre 1:50 y 1:70.

2.3 Prueba ortogonal de hidrólisis ácida

A partir del experimento de factor único de hidrólisis ácida, se sabe que los factores que afectan la hidrólisis ácida son principalmente la concentración de ácido, la relación sólido-líquido y el tiempo, y cada uno se selecciona en consecuencia. Para los tres niveles de factores, los resultados experimentales se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Resultados y análisis de la prueba ortogonal de hidrólisis ácida

Columna A B C

Factor tiempo (h) Acidez (M) Rendimiento de aminoácidos sólido-líquido (%)

Experimento 1 1 (8) 1 (3) 1 (1:50) 69,1

Experimento 2 2 (9) 2 (3,5) 2 (1:60) 73,2

Experimento 3 3 (10) 3 (4) 3 (1:70) 71,9

Experimento 4 2 1 2 87,2

Experimento 5 2 2 3 89,1

Experimento 6 2 3 1 86,5

Experimento 7 3 1 3 78,4

Experimento 8 3 2 1 80,3

Experimento 9 3 3 2 79,6

El valor promedio 1 71.400 78.233 78.633

El valor promedio de 2 87.600 80.867 80.000

Promedio 3 79.433 79.800

Diferencia extrema 16.200 2,634 1,367

De la Tabla 2, la combinación con mayor rendimiento de acidólisis es A2B2C3, pero de la Tabla 4, la combinación ideal es A2B2C2, por lo que se compara nuevamente A2B2C2 y el resultado es que el aminoácido de fibroína de seda El rendimiento es del 89,8 % ligeramente mejor que el A2B2C3, por lo que se determina que las condiciones óptimas para la acidólisis son una concentración de ácido de 3,5 M, una relación sólido-líquido de 1:60 y acidólisis a 110 °C durante 9 horas.

2.4 Resultados de la disolución de la fibroína de seda con CaCl2

Las características de disolución de la fibroína de seda en una solución de CaCl2 son bastante especiales. Casi no se disuelve cuando la concentración es inferior al 35% o superior. 55%, como se muestra en la Tabla 3. 40% es lo mejor.

Tabla 3 La relación entre la concentración de CaCl2 y la disolución de la fibroína de seda

1 2 3 4 5 6 7 8

Concentración de CaCl2 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65%

Solubilidad de la fibroína de seda 0 14,5% 100% 32,5% 15,5% 0 0 0

2,5 Determinación de la hidrolasa óptima

Papaína El pH se controla a 6,0, la temperatura es 50°C, E/S=10% y la concentración del sustrato, es decir, la concentración de fibroína de seda, es del 4% para la hidrólisis enzimática. Los experimentos muestran que la tasa de hidrólisis enzimática aumenta rápidamente en la primera hora, alcanza 0,07 mg/ml en 3 horas y luego aumenta lentamente. La tripsina se utiliza para la hidrólisis enzimática a pH 8,0, temperatura 40°C, E/S=2% y concentración de fibroína de seda del 4%. Alcanza el valor máximo de 0,053 mg/ml en 7h.

La proteasa neutra hidroliza enzimáticamente la fibroína de seda a pH 7,0, temperatura 50°C, E/S=2% y concentración de fibroína de seda 4%, alcanzando 0,065 mg/ml en 3 horas. Se puede ver que la papaína tiene el mejor efecto de hidrólisis.

2.6 Experimento ortogonal de papaína hidrolizando fibroína de seda

Realizar un experimento ortogonal para determinar la mejor combinación de condiciones para que la papaína hidrolice la fibroína de seda. Las condiciones enzimáticas óptimas para la papaína son pH 5,5, temperatura 55°C, concentración de sustrato 5% y cantidad de enzima 10%. Al final se pueden obtener 0,184 g de aminoácidos a partir de 1,001 g de fibroína de seda. De la comparación de la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática de la fibroína de seda, se puede concluir que la hidrólisis ácida es obviamente mejor que la hidrólisis enzimática.

2.7 Preparación de bebidas

Al preparar bebidas, se debe prestar atención al ajuste del sabor. Los principales factores que afectan el sabor de esta bebida son la concentración de aminoácidos, la concentración de hierbas medicinales chinas. y concentración de azúcar. Por lo tanto, se diseña un experimento ortogonal horizontal de 3 factores para optimizar recetas de bebidas. Como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4 Resultados y análisis de la preparación de bebidas

Columna A B C

Factores Aminoácidos Medicina herbaria china Concentración de azúcar (%) Resultados experimentales

Concentración (%) Concentración (%)

Experimento 1 1 (0,3) 1 (2) 1 (8) 7,8

Experimento 2 1 2 (3) 2 (9) 7,4< /p >

Experimento 3 1 3 (4) 3 (10) 7,2

Experimento 4 2 (0,4) 1 2 9

Experimento 5 2 2 3 8,5

Experimento 6 2 3 1 8

Experimento 7 3 (0,5) 1 3 7,6

Experimento 8 3 2 1 7

Experimento 9 3 3 2 7,5

Media 1 7,467 8,133 7,600

Media 2 8,500 7,633 7,967

Media 3 7,367 7,567 7,767

Rango 1,133 0,566 0,367

La fórmula óptima de la bebida se puede obtener de la Tabla 4: la concentración de aminoácidos es 0,4%, la concentración de jugo de hierbas chinas es 2%, la concentración de azúcar es 9% y una pequeña cantidad de sabor melocotón y VC se añaden para obtener el producto terminado.

2.8 Prueba de estabilidad de almacenamiento de bebidas

En esta prueba se realiza la esterilización antes y después del enlatado, y el jugo de hierbas chinas se centrifuga, por lo que la bebida obtenida es clara y transparente. Después del enlatado, observe su estabilidad a través de diferentes tiempos de esterilización. Esterilizar a 90 °C durante 15 min, 20 min y 25 min respectivamente, luego enfriar y colocar en una incubadora a temperatura constante de 37 °C para observación. No hubo cambios después de 9 días y todavía era una solución clara y transparente de color amarillo-marrón.

Para determinar el tiempo óptimo de esterilización, el producto terminado después de 9 días de almacenamiento se sometió a un experimento de detección de bacterias. El resultado fue que el número total de bacterias después de la esterilización a 90°C durante 25 minutos. fue 56/ml, lo que cumplió con los requisitos estándar nacionales.

3 Estándares de calidad del producto

3.1 Indicadores sensoriales

Color: marrón amarillento, uniforme. Sabor: agridulce, con ligero amargor de aminoácidos de fibroína de seda y hierbas medicinales chinas, sin olor peculiar. Forma del tejido: El jugo es transparente, sin impurezas y no aparece precipitación después de un largo tiempo de reposo.

3.2 Indicadores físicos y químicos

Acidez: pH 3,5 ~ 4,0, recuento bacteriano total ≤100/ml, recuento de coliformes ≤3/ml, no se detectarán bacterias patógenas.

4 Conclusión

La hidrólisis ácida de la fibroína de seda tiene un mayor rendimiento de aminoácidos que la hidrólisis enzimática. El rendimiento de la hidrólisis ácida es del 89,1%, mientras que el rendimiento de la hidrólisis enzimática es solo del 18,1%. Dado que la hidrólisis ácida es más fácil de operar que la hidrólisis enzimática y el color y el olor del hidrolizado son mejores, la hidrólisis ácida se utiliza al preparar bebidas. La condición óptima de desgomado determinada es un tratamiento de ebullición con Na2CO3 al 0,5% durante 30 minutos. En esta condición, se elimina toda la sericina y no hay pérdida de fibroína de seda.

Después del desgomado, la fibroína de seda se lavó y secó y luego se acidólisis. Las condiciones óptimas del proceso para la acidólisis fueron 3,5MH2SO4, relación sólido-líquido 1:60, hidrólisis a 110°C durante 9 horas y el rendimiento de aminoácidos fue tan alto como. 89,8%. La solución de aminoácidos desacidificada por la resina de intercambio catiónico se mezcló con hierbas medicinales chinas. La fórmula óptima para la bebida fue la siguiente: concentración de aminoácidos de fibroína de seda del 0,4%, concentración de hierbas medicinales chinas del 2%, concentración de azúcar del 9% y concentración de VC. 0,2%. Esto produce una bebida clara, agridulce y leonada.