Análisis de casos de experimentos de RT-PCR——Zhongding Biotechnology
Resumen experimental
Extraiga el ARN total de la muestra con TRIzol y obtenga ADNc mediante transcripción inversa para experimentos posteriores.
1. Reactivos y consumibles
Reactivos y consumibles
kit de síntesis de ADNc de primera hebra prime Script II, Bao Bioengineering (Dalian) Co., Ltd. 6210B; TRIzol, reactivo de extracción de ARN total, Nanjing Zhongding Biotechnology Co., Ltd., rk 01-100;
ADN marcado con DL2000 (100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 pb), Nanjing Novozan; Biotecnología Co., Ltd., MD101. GelStain, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd., GS 101-01;
DEPC, Sigma, d 5758-25ml;; Agarosa, Biowest, España, 91622;
Tubo de centrifugación , Axygen, EE. UU., 311-01-051; Pipe tip, Axygen, EE. UU.;
Otros reactivos son de grado analítico en China.
2. Principales instrumentos experimentales
Principales instrumentos experimentales
Espectrofotómetro ultravioleta: NanoDrop2000, Thermo Company; centrífuga refrigerada de alta velocidad de escritorio, Beckman Company, Allegra 21R; ;
Balanza electrónica, AHOMS Company, ar 5120;; transiluminador UV, Amersham Pharmacia Company, Hofer MV-25;
Instrumento de electroforesis: TY2795, BIO-RAD Company; Células GT subcelulares, BIO-RAD Company;
Sistema de análisis de imágenes de gel: modelo GelDocXR, BIO-RAD Company, máquina de hielo Snowflake, Sanyo Corporation de Japón, SIM-f 140 ay 65;
Pipeta, Eppendorf, Alemania.
3. Métodos experimentales y resultados
3.1. Extracción de ARN
(1) Homogeneizado de tejido: Añadir 1 ml de reactivo TRIzol (bloque de tejido) a la muestra. el volumen no debe exceder el 10% del volumen de TRIzol), soplar repetidamente con una pipeta.
(2) Colocar el homogeneizado a temperatura ambiente durante 5 minutos hasta que el ácido nucleico y la proteína se disocian por completo. Añadir 0,2 ml de cloroformo a la suspensión homogénea de 1 ml de reactivo TRIzol, tapar bien el tubo de ensayo, agitar vigorosamente manualmente durante 15 segundos y luego dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos.
(3) Centrifugar a 10.000 gramos durante 10 minutos a 4°C.
(4) Absorber con cuidado la fase acuosa superior (incolora) y añadirla a un tubo de ensayo nuevo. Al mismo tiempo, calcular el volumen de la fase acuosa absorbida.
(5) Agregue un volumen igual de alcohol isopropílico preenfriado, cierre bien la tapa del tubo y agite suavemente.
(6) Dejar reposar a temperatura ambiente durante 65.438±00 minutos hasta que el ARN precipite por completo.
(7) Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a 4°C.
(8) Deseche el sobrenadante (tenga cuidado de no desechar el precipitado), agregue 1 ml de etanol al 75% a cada tubo de ensayo, cubra bien el tubo de ensayo y agite suavemente el tubo de centrífuga para eliminar cualquier resto. materia extraña restante. Centrifugar a 7.500 durante 5 minutos a 4°C
(9) Desechar el sobrenadante, abrir la tapa del tubo, precipitar y secar el ARN (evaporar a temperatura ambiente o secar al vacío). Tenga en cuenta que el sedimento de ARN no puede estar completamente seco, de lo contrario será difícil disolverlo.
(10) Disolver el pellet de ARN en una cantidad adecuada de agua libre de RNasa.
3.2. Análisis de electroforesis en gel de agarosa
El ARN extraído se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El patrón de electroforesis es el siguiente:
3.3. Prueba de pureza
3.4. Transcripción inversa de ARN en ADNc
3.4.1 Eliminación de ADN genómico
Utilice DNasa I de Zhongding Company sin RNasa. Prepare lo siguiente. solución mezclada en un tubo de centrífuga:
3.4.2. Reacción de transcripción inversa
Preparar la siguiente mezcla de reacción en un tubo de PCR:
Reaccionar a 65°C 5 min y luego enfriar en un baño de hielo.
Preparar la siguiente solución de reacción de transcripción inversa en el tubo de reacción del primer paso:
Las condiciones para la reacción de transcripción inversa son: 30°C durante 10 minutos, 42°C durante 30 minutos y 95°C durante 5 minutos. Enfriar en baño de hielo. El producto se conserva en frigorífico a -20°C.
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