¿Cómo controlar la secuenciación de cdna desde la secuenciación del extremo 3' y la secuenciación del extremo 5'?
La secuenciación de alto rendimiento, también conocida como "tecnología de secuenciación de próxima generación", se caracteriza por la capacidad de secuenciar cientos de miles a millones de moléculas de ADN en paralelo al mismo tiempo y, generalmente, tiene una longitud de lectura corta. .
Según el historial de desarrollo, la influencia, los principios y las tecnologías de secuenciación, existen principalmente los siguientes tipos: secuenciación masiva de firmas paralelas, MPSS, secuenciación Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación sólida ABI, La secuenciación de semiconductores de iones, la secuenciación de nanoesferas de ADN y otros analizadores genéticos (secuenciadores de ADN) utilizan tecnología de electroforesis capilar en lugar de la electroforesis tradicional en placas de poliacrilamida, y utilizan el ddNTP (método de terminador etiquetado) marcado con tinte fluorescente de cuatro colores patentado por la compañía. Por lo tanto, mediante una reacción de secuenciación por PCR con un solo cebador, el producto de PCR generado es una mezcla de ADN monocatenario con cuatro tintes fluorescentes diferentes en el extremo 3', que difieren en 1 base, de modo que los productos de secuenciación de PCR de los cuatro tintes fluorescentes pueden Estar en un tubo capilar Electroforesis, evitando carriles de nado. La movilidad en la electroforesis capilar también es diferente debido a los diferentes tamaños de las moléculas. Un detector de cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) en la ventana del detector láser puede detectar moléculas fluorescentes una por una a medida que pasan a través de la ventana de lectura capilar. La fluorescencia excitada se segmenta mediante una rejilla para distinguir diferentes colores de fluorescencia que representan información diferente del sustrato, y las imágenes se sincronizan en una cámara CCD. El software de análisis puede convertir automáticamente diferentes fluorescencias en secuencias de ADN para lograr el propósito de la secuenciación del ADN. Los resultados del análisis se pueden generar en diversas formas, como patrones de electroforesis en gel, patrones de picos de absorción de fluorescencia o secuencias de disposición de bases.
Es un instrumento de precisión avanzado que utiliza control automático por ordenador, como llenado automático de gel, muestreo automático, recogida y análisis automático de datos, para medir la secuencia de bases, el tamaño y la cuantificación de fragmentos de ADN. PE también ofrece polímeros en gel, incluidos geles de secuenciación de ADN (POP 6) y geles GeneScan (POP 4). Los tamaños de poro de estas partículas de gel son uniformes, lo que evita el impacto de condiciones de preparación de gel inconsistentes en la precisión de la secuenciación. Consiste principalmente en un dispositivo de electroforesis capilar, una computadora Macintosh, una impresora a color y accesorios de electroforesis. Las computadoras incluyen software para la recopilación de datos, el análisis y la operación de instrumentos. Utiliza el último detector de cámara CCD para acortar la secuenciación de ADN a 2,5 horas y el análisis del tamaño de los fragmentos de PCR y el análisis cuantitativo de 10 a 40 minutos.