Ejemplos de conceptos inventivos generales que solicitan una patente para dos o más invenciones.
Documento de reivindicación de derechos
1. Nucleótidos específicos para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y Escherichia coli O152, caracterizados por
Por tanto, es un aislado. nucleótido como se muestra en SEQ ID NO: 1, con una longitud total de 12235 bases.
2. El antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y Escherichia coli O152 según la reivindicación 1.
Los nucleótidos se caracterizan por estar compuestos por 10 genes, que se sitúan entre el gen galF y el gen gnd.
3. Núcleo específico para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y E. coli O152 según reivindicación 2.
Ucósido, caracterizado porque el gen es:
Los genes relacionados con el transporte y procesamiento incluyen genes wzx o genes con funciones similares a wzx, genes wzy o genes relacionados con WZX.
Wzy tiene genes con funciones similares;
genes de glicosiltransferasa, incluidos los genes orf5, orf7, orf9 y orf10 entre los que se encuentra el gen:
Orf5 es SEQ ID; NO: 1 tiene de 4626 a 5663 bases de nucleótidos;
Wzx es SEQ ID NO: 1 tiene de 5663 a 6874 bases de nucleótidos
Orf7 es el nucleótido de 6877 a 7869 en; SEQ ID NO: 1;
Wzy es el nucleótido de las bases 7882 a 8955 de SEQ ID NO: 1;
Orf9 es el nucleótido que tiene de 8960 a 9721 bases en SEQ ID NO: 1;
Orf10 es el nucleótido que tiene de 9718 a 10788 bases en SEQ ID NO: 1.
4. Antígeno O específico para Shigella Dysenteriae 12 y E. coli O152 según las reivindicaciones 1-2.
El nucleótido se caracteriza por derivar del gen wzx, gen wzy o de los genes de la glicosiltransferasa orf5, orf7,
Orf9 y orf10 o de los genes de la ruta de síntesis de azúcares; mezclas de los mismos o combinaciones de los mismos.
5. Núcleo específico para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y E. coli O152 según reivindicación 4.
El oligonucleótido se caracteriza porque el oligonucleótido es:
El par de oligonucleótidos derivado de orf5:
En seq id no:1 4866-4886 nucleótidos y 5573 -5591 nucleótidos,
Nucleótidos 5156 a 5176 y 5587 a 5595 nucleótidos en SEQ ID NO: 1,
Seq id no: 4641 a 4660 nucleótidos y 5302 a 5320 nucleótidos en 1;
Par de oligonucleótidos derivados de wzx:
Seq id no: 189 a 6207 nucleótidos y 1 en 6731 a 6750 nucleótidos,
Seq id no: 5713 a 5733 nucleótidos y 1 en 6724 a 6741 nucleótidos,
Seq id no: 6463 a 6481 nucleótidos y 6821 a 6839 nucleótidos en 1;
Par de oligonucleótidos derivado de orf7:
p >Nucleótidos 7024 a 7041 y nucleótidos 7779 a 7800 en SEQ ID NO: 1,
El núcleo de las bases 6972-6992 en SEQ ID NO: 1 Número SEQ ID: 7131 a 7148 bases y 7693 a 7674 bases en 1;
Número SEQ ID: 7131 a 7148 bases
p>
Par de oligonucleótidos de wzy:
Nucleótidos 7883-7903; y 8903-8921 en seq id no:1,
SEQ ID NO: 1, los nucleótidos en las bases 8049-8069 y los nucleótidos en las bases 8876-8894,
Seq id no : 197 a 8214 bases y nucleótidos Nucleótidos de 8197 a 8214 bases;
Par de oligonucleótidos derivados de orf9:
Nucleótidos de 9020 a 9040 bases en SEQ ID NO: 1 y nucleótidos de bases 9630 a 9647,
Nucleótidos de las bases 8982-9000 y nucleótidos de las bases 9443-9462 en SEQ ID NO: 1,
Seq id no: 9165 a 9183 nucleótidos de base y 1 9525 a 9543 nucleótidos de bases;
Par de oligonucleótidos derivados de orf10:
Seq ID NO: 9752-9770 nucleótidos y 10567-10586 nucleótidos en 1,
SEQ ID NO: 1 nucleótidos 9165 a 9183 y 9525 a 9543 núcleos Orina,
Seq id no: 9934-9952 nucleótidos y 1 de 10513-10530 nucleótidos.
6. Nucleótidos específicos para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y E. coli O152 según reivindicación 1.
Aplicación de la detección in vitro de bacterias que expresan antígeno O.
7. Según la reivindicación 1, un núcleo específico para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y Escherichia coli O152.
Las características de aplicación de los glucósidos son como cebadores para PCR y como sondas para reacciones de hibridación, detección de fluorescencia y fabricación.
Se utilizan chips o microarrays de genes para detectar Shigella Dysenteriae 12 o Escherichia coli O152 in vitro.
8. Nucleótidos específicos para el antígeno O de Shigella Dysenteriae 12 y E. coli O152 según reivindicación 1.
El método de aislamiento se caracteriza por incluir los siguientes pasos:
1) Extracción del genoma.
Shigella se cultivaron en medio LB a 37 °C durante la noche y las células se recogieron mediante centrifugación. Utilice Tris-HCl con un pH de 8,0.
Luego se incuba a 37°C durante 20 minutos, se agrega lisozima para descomponer las bacterias y se agrega proteinasa K y SDS para degradar los huevos.
Materia blanca, luego agregue ribonucleasa para eliminar el ARN; agregue un volumen igual de mezcla de extracción de fenol, tome el sobrenadante y extraiga ambos con volúmenes iguales de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico.
veces para eliminar enzimas y proteínas, y luego extraer el fenol restante con un volumen igual de éter dietílico. Use tiempos diploides b
Precipite el ADN con alcohol, use un rodillo de fibra de vidrio para extender el ADN, lave el ADN con etanol al 70% y finalmente resuspenda el ADN con 30 μl de TE.
Detecta ADN del grupo A mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,4%.
2) Amplificación por PCR larga del cluster de genes del antígeno O tipo 12 de Shigella Dysenteriae.
En primer lugar, el cebador ATT aguas arriba se diseña basándose en la secuencia inicial común en la región promotora del grupo de genes del antígeno O.
GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT, y luego diseñar cebadores posteriores basados en el gen gnd posterior al grupo de genes del antígeno O.
-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C; utilice la plantilla de longitud extendida de Boehringer Mannheim
para amplificar por PCR el grupo de genes del antígeno O, y el programa de reacción de PCR es: Pre -desnaturalización a 94°C durante 2 minutos; luego desnaturalización a 94°C durante 10 segundos, recocido a 60°C durante 30 segundos, extensión a 68°C durante 15 minutos, y este ciclo finalmente, a 68°C;
Continúe extendiendo a ℃ durante 7 minutos para obtener productos de PCR; combine 6 tubos de productos de PCR y use Promega's Wizard
Los productos de PCR se purifican con el kit de purificación PCR Preps;
3)O -Construcción de la biblioteca de grupos de genes de antígenos
La biblioteca de grupos de genes de antígenos O se construyó utilizando el método de escopeta Novagen DNaseI modificado y el sistema de reacción fue de 300 ng.
Producto purificado por PCR, 0,9 μl de MnCl2 0,1 M, 1 μl de ADNasa I diluida 1:2000, reacciona a temperatura ambiente.
Realizar digestión enzimática durante 10 minutos para concentrar el tamaño de los fragmentos de ADN digeridos entre 1 kb-3 kb, luego agregar 2 μl de EDTA de 0,1 m.
Terminar la reacción, combinar cuatro sistemas de reacción idénticos, extraer una vez con un volumen igual de fenol y una vez con un volumen igual de fenol:cloroformo.
Extraer la solución mixta de isopropanol una vez; la proporción de volumen de mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico es 25:24:1; luego use el mismo volumen. Después de extraer una vez con éter, use 2,5 veces de etanol absoluto para precipitar el ADN y use 70 % Lavar con etanol y finalmente resuspender en 18μl de agua luego se agregan a la mezcla 2.5μl de DNTP, que contiene 1mMdCTP, 1mMdGTP y 1mMdTTP;
Además de 10 mMdATP, 1,25 μl de 100 MMD DTT y 5 unidades de ADN polimerasa T4, el producto se digirió a 0 °C durante 30 minutos.
Después de finalizar la reacción a 75°C, añadir 5 unidades de ADN polimerasa Tth y su tampón.
Amplifica el sistema a 80μl y añade una cola dA al extremo 3' del ADN. Mezclar la mezcla con cloroformo
Extraer con solución mixta de alcohol isoamílico y éter, luego conectar con el vector pGEM-T-Easy a 65438±06°C durante 24 horas, el volumen total es
90 µl, incluidas 25 unidades de ADN ligasa T4 y 9 µl de tampón que contiene 10x ADN ligasa T4, 1/10 final.
Precipitar la mezcla de ligación con un volumen de NaAc 3M a pH = 5,2 y el doble del volumen de etanol absoluto, lavar con etanol al 70% y luego disolver en 30 μl.
Obtener la Producto de ligadura en agua. Se preparó E. coli competente mediante el método de electroconversión de Bio-Rad para preparar células competentes.
Para las células de la cepa DH5α, tome 2-3 μl de producto de ligación y 50 μl de E. coli DH5α competente y luego transfiéralo a Bio-Rad.
La copa de descarga eléctrica de 0,2 cm de la compañía descarga, voltaje de 2,5 kV, tiempo de 5,0 milisegundos a 6,0 milisegundos. Después del electroshock,
Agregue 1 ml de medio SOC a la copa para resucitar las bacterias y luego cubra las bacterias con ampicilina, X-Gal e IPTG.
Cultivo en medio sólido LB a 37°C durante la noche, y al día siguiente se obtuvieron colonias azules y blancas. Las colonias blancas obtenidas por transformación son clones blancos.
Mientras se cultivaba en medio sólido LB que contenía ampicilina, se extrajeron los plásmidos de cada clon y se digirieron con EcoRI.
Se determinó el tamaño del fragmento insertado y la población de clones blancos obtenida constituyó el gen del antígeno O de Shigella Dysenteriae tipo 12.
Biblioteca de clúster;
4) Obtener la secuencia completa del clúster de genes del antígeno O
Seleccionado de la biblioteca de genes del antígeno O producida por Shanghai Bioengineering Company 120 clones con inserciones superiores a 700 pb.
La empresa utiliza el secuenciador automático de ADN ABI377 para realizar la secuenciación unidireccional de los fragmentos insertados en los clones, consiguiendo una tasa de secuenciación del 80%.
Diseñar el 20% restante de la secuencia en base a la secuencia obtenida, y luego diseñar cebadores a partir de las bases de Shigella Dysenteriae tipo 12
Mediante PCR directa en ADN y análisis de el producto de PCR La secuenciación se realizó para obtener todas las secuencias del grupo de genes del antígeno O, y todas las secuencias se obtuvieron utilizando la espada británica.
El paquete Staden Pregap4 publicado por el Laboratorio de Biología Molecular del Bridge Medical Research Council. .
Utilice el software Gap4 para empalmar y editar todas las secuencias para obtener el núcleo del grupo de genes del antígeno O tipo 12 de Shigella Dysenteriae.
La calidad de la secuencia de nucleótidos de longitud completa se garantiza principalmente a través de dos aspectos: (1) Seis PCR largas por genoma.
Reacción y luego mezclar estos productos para generar una biblioteca (2) Para cada base, garantizar una cobertura de alta calidad de más de 3 bases.
5) Obtener antígeno O; grupos de genes La estructura de Shigella Dysenteriae se descubrió utilizando el buscador del Centro Nacional de Información Biotecnológica
El gen se encontró en la secuencia de nucleótidos del grupo de genes del antígeno O de 12 cepas de blastos y se descubrieron 10 abiertos. marcos de lectura.
El software se compara con los genes en GenBank para encontrar las funciones de estos marcos de lectura abiertos y determinar qué genes son. Luego
el software Artemis de Sanger del Reino Unido completa la anotación genética. La secuenciación del centro, del ADN y de las proteínas se realizó mediante el software ClustTralw.
A través de una comparación precisa columna a columna, finalmente se obtuvo la estructura del grupo de genes del antígeno O tipo 12 de Shigella Dysenteriae.