Primera introducción al sistema cre flox
Jajaja, porque siempre he sido un top en la clínica y en el laboratorio, sintiéndome un desastre y no entiendo nada. Ahora estoy empezando a ser una persona nueva. Examinaré más de cerca todo lo que veo. Siempre he oído hablar de cre, loxp, reporter, etc. en reuniones de grupo, pero no los entiendo. Difícil. He ido a descubrir qué son los fantasmas.
No sabía nada sobre esto antes y nunca había estado expuesto a experimentos con ratones genéticamente recombinantes. Leí algunos artículos relacionados que involucraban esta tecnología de recombinación de genes. Me enteré por un amigo y aprendí que Cre-Lox es una tecnología muy utilizada en pruebas con animales. El contenido que he compilado es lo que entiendo actualmente. Corríjame si hay algún problema. Muchas gracias con lágrimas en los ojos. También espero brindar información útil a quienes no la conocen.
Cre fue el primer gen descubierto en microorganismos. Puede codificar la recombinasa Cre. La recombinasa Cre puede reconocer secuencias específicas. Esta secuencia se llama secuencia Loxp y tiene 34 pb de longitud. La recombinasa Cre reconocerá la secuencia de Loxp y modificará el gen/secuencia antes de Loxp (dependiendo de la dirección de Loxp, se recomienda leer la introducción detallada en Wikipedia, céntrese aquí), esta tecnología se usa a menudo para eliminar genes.
Generalmente, esta tecnología de recombinación genética utiliza la hibridación. Por ejemplo, un gen específico A (el gen que nos interesa, como un gen de expresión de estado celular/tejido específico) en el ratón padre fue modificado e insertado en la secuencia del gen Cre durante el período embrionario, de modo que el genoma de todas sus células Este gen específico contiene la secuencia del gen Cre. La expresión y traducción del gen Cre se ven afectadas por el promotor del gen específico A. Es decir, si el gen A está activado/puede transcribirse en una célula, entonces el gen Cre también se activará/podrá transcribirse.
Sin embargo, aún no ha terminado. Una vez que Cre se transcribe, el propósito es codificar una proteína, algo llamado Cre recombinasa, que también requiere FLox. Por lo general, Loxp estará en la madre ratón y el propósito es cortar la secuencia o gen entre los dos Loxp para que desempeñe un determinado papel biológico. Lo que se utiliza también se menciona en este artículo que leí. Las células embrionarias comienzan a transferir la secuencia Loxp entre los dos exones de la región/gen Rosa26 de la madre ratón (se dice que se hace de esta manera), y hay una. Gen STOP en el medio de Loxp, esta secuencia puede evitar que se transcriban genes posteriores, similar a un sitio de parada de la transcripción. Todavía se encuentra entre los dos exones del gen Rosa26 inmediatamente después de Loxp-stop-Loxp. Y se agregan algunos genes reporteros. Los genes reporteros generalmente incluyen LacZ, GFP, YFP, etc. (Si no comprende estos genes reporteros, se recomienda leer la introducción detallada en Wikipedia, cuyo enfoque se centra aquí). Por lo tanto, en circunstancias normales, el gen Rosa26 en todas las células del ratón madre se transcribe a la secuencia STOP y luego se detiene. Otra cosa a mencionar es que el gen Rosa26 se transcribe en casi todas las células/tejidos de ratones (el promotor está funcionando), pero este gen no es muy útil, por lo que todas las modificaciones y adiciones que hagas aquí no afectarán los problemas de salud. en ratones. Entonces, ahora que tenemos el ratón padre con gen A Cre y el ratón madre reportero Rosa26-Loxp, el siguiente paso es permitirles dejar de ociosidad en la fabricación de ratones. Sus hijos generalmente están marcados como A-Cre::RLacZ/A-Cre::RGFP/A-Cre::RYFP/ etc. ¿Qué significa "::"? Sí, "híbrido", por lo que este ratón híbrido es generalmente la muestra objetivo de la investigación. Debido a que los ratones nacidos en esta generación contienen dos genes modificados al mismo tiempo, uno es el gen A y el otro es la región/gen Rosa26. El gen diana A generalmente debe ser específico, expresado solo en ciertas células o tejidos (algunos genes marcadores), luego Cre también se expresará en estas células/tejidos donde se expresa el gen A, porque Cre está estrictamente controlado por A El promotor de el gen se regula y luego el ARNm de Cre se codifica en la recombinasa Cre y sale a trabajar (la función principal de la célula es la proteína). Con la expresión de la recombinasa Cre, el gen STOP dentro de los dos exones de Rosa26 y entre las dos secuencias de Loxp se cortará. Entonces, sí, el gen Repoter posterior comienza a transcribirse y las heces se vuelven suaves. Por lo tanto, podemos detectar indirectamente estas células mediante la detección del producto del gen Repoter, como tinción de tejidos, tinción de hibridación in situ (ISH), detección de fluorescencia, etc.
Quizás en este momento te preguntes: ¿no sería fácil simplemente agregar un gen informador directamente después del gen específico? ¿Por qué tomarse todas estas molestias? Aún necesitas tener relaciones sexuales después de hacer esto.
El punto clave aquí es que si se agrega Cre después del gen A, o si se agrega un gen indicador directamente, serán regulados directa/inmediatamente por la actividad del gen A, lo que no ocurre de manera muy sincrónica con los ratones genéticamente recombinantes; Una vez que se expresa la recombinasa Cre, cortará irreversiblemente el gen STOP de la célula y el gen indicador continuará expresándose. Es decir, incluso si el gen Cre ya no se transcribe, seguirá viendo el gen indicador. expresado en la célula, y de repente sentirás que La persona que desarrolló esta tecnología es tan asombrosa, por lo que esta tecnología de recombinación de genes generalmente se puede usar para rastrear y examinar algunas transformaciones y diferenciaciones del estado celular: "Te reconoceré incluso si cambias". ".
El sistema Cre/LoxP se deriva del fago F1 y es una tecnología de edición genética muy clásica y eficaz.
La Cre recombinasa (ciclizaciónrecombinación) es una proteína monomérica compuesta por 343 aminoácidos que puede desencadenar la recombinación del ADN en el sitio loxP.
Cre es una recombinasa que puede reconocer sitios LoxP.
Cre inducible: estas construcciones requieren la adición de un ligando exógeno (por ejemplo, tamoxifeno) para activar Cre. Una ventaja de este sistema es la estricta regulación temporal.
(1) Cre inducible: Estas estructuras requieren la adición de ligandos exógenos (como el tamoxifeno) para activar Cre. Una ventaja de este sistema es la estricta gestión del tiempo: ¡este es el que más utilizamos!
Cre regulada por el promotor: la región del promotor define las áreas en las que Cre se expresará globalmente bajo un promotor ampliamente activo como CAG, o se expresará solo en un subconjunto de células bajo un promotor más específico. promotor (por ejemplo, Rho-Cre se expresa en la retina).
(2) Cre regulada por el promotor: la región promotora define la región de expresión de Cre. Cre puede expresarse globalmente bajo un promotor ampliamente activo (p. ej., CAG) o puede expresarse solo en un subconjunto de células bajo un promotor específico (p. ej., Rho-Cre se expresa en la retina).
Cre fluorescente: la fusión de Cre con un gen informador fluorescente permite la visualización de la expresión de Cre.
(3) La fusión de Cre y un gen informador fluorescente permite la visualización de la expresión de Cre: ¡Se puede ver directamente la fluorescencia!
Cre optimizado: Cre con codones optimizados (iCre) se expresa en niveles más altos en ratones que el bacteriófago P1 Cre, lo que facilita altas tasas de recombinación impulsada por Cre. CREM (o Cre-M) ha sido diseñado para contener. un intrón, que previene la expresión de Cre durante la clonación en E. coli. Esta alteración permite la generación de un único vector que contiene Cre y una construcción floxada (Cre no modificada provocará la recombinación en E. coli, eliminando la porción floxada de una construcción durante el proceso de clonación). VCre y SCre son recombinasas Cre alternativas que reconocen sitios loxP mutantes específicos, sitios VloxP y SloxP respectivamente.
(4) Hmm... qué complicado
Split Cre: recombinasa Cre). se divide por la mitad en fragmentos Cre N y C terminales (NCre y CCre, respectivamente) y se coloca bajo el control de diferentes promotores. La expresión de N y CCre en el mismo tipo de célula permite la recombinación de secuencias de ADN flanqueadas por LoxP. >
(5) Divida la recombinasa Cre en fragmentos Cre N y C-terminales (NCre y CCre respectivamente) y colóquelos bajo el control de diferentes promotores. La expresión de N y CCre en el mismo tipo de célula permite la recombinación de secuencias de ADN que flanquean a LoxP.
loxP es una secuencia de ADN de 34 pb de largo, que es el sitio reconocido por la recombinasa y se llama sitio loxP (10cus de X—sobre en P1).
Materiales de referencia:
/blog/introduction-to-cre-lox
https://www.addgene.org/cre-lox/
p>
Estas estructuras LoxP permiten que crec regule la expresión genética, y Cre puede activar o reprimir la expresión genética, dependiendo de su estructura. Los tipos de constructos comunes incluyen:
(1) Expresión genética dependiente de Cre: aguas arriba del gen de interés, en cualquier lado (a menudo llamado cuadro "lox-stop-lox" o "LSL"). El codón de parada con un sitio loxP previene la expresión génica en ausencia de Cre. En presencia de Cre, se elimina el codón de parada y continúa la expresión génica.
¿Por qué de repente mencionas AAVS1? Esto se debe al LoxP mencionado anteriormente, ya sabemos que LoxP debe colocarse en el intrón del gen objetivo (el medio es el exón, preferiblemente el exón de la región funcional).
¿Y qué debería hacer Cre si quiere expresarse de manera estable? En este momento, debemos aprovechar la función del sitio AAVS1. Los kits existentes pueden lograr esto. El sitio AAVS1 (también conocido como sitio PPP1R2C) está ubicado en el cromosoma 19 del genoma humano. Es un sitio de "puerto seguro" verificado que puede garantizar la función esperada del fragmento de ADN transferido. Este sitio es una estructura cromosómica abierta que garantiza que el gen transferido pueda transcribirse normalmente. Otro punto muy importante es que la inserción del fragmento diana exógeno en este sitio no tiene efectos secundarios conocidos sobre las células.