Habilidades de aplicación de la membrana NC de membrana de nitrocelulosa
1. El principio de unión de la proteína y la membrana
El principio de unión de la proteína y la membrana Las fuerzas de unión conocidas incluyen fuerza hidrofóbica, enlace H, fuerza electrostática, etc. El principio vinculante exacto no está claro y se apoya principalmente en hipótesis. Hay dos hipótesis principales:
1) Primero, se combinan mediante fuerza electrostática y luego se combinan durante mucho tiempo mediante enlaces H e interacción hidrofóbica.
2) Primero combine mediante interacción hidrofóbica y luego combine mediante interacción electrostática durante mucho tiempo.
Ambas hipótesis indican que el proceso de vinculación se divide en dos pasos, primero la vinculación y luego la vinculación a largo plazo. Debido a la ambigüedad de los principios combinatorios, el trabajo en este campo depende en gran medida de la experiencia práctica.
2. El efecto de la membrana en la unión
1) Tamaño de los poros de la membrana
Algunos técnicos tienden a utilizar el tamaño de los poros de la membrana para distinguir diferentes membranas, pero tenga en cuenta , esto se limita a productos del mismo fabricante. Si los productos son de diferentes fabricantes, esta comparación no tiene sentido. La relación entre el tamaño de los poros de la membrana y la velocidad cromatográfica se ha descrito anteriormente. A medida que disminuye el tamaño de los poros de la membrana, aumenta el área de superficie real disponible de la membrana y también aumenta la cantidad de proteínas unidas a la membrana. El parámetro utilizado para estimar el área de superficie es la relación de área de superficie (la relación entre el área de superficie disponible real y el área plana de la membrana utilizada).
Además, cuanto menor sea el tamaño de poro de la membrana, menor será la velocidad de la cromatografía. Por tanto, cuanto más tiempo tarde el complejo marcado con oro en atravesar la línea T, más completa será la reacción. ser.
Basándonos en los dos puntos anteriores, podemos concluir que cuanto menor sea el tamaño de los poros de la membrana, mayor será la sensibilidad. Pero también ralentiza la velocidad de carrera y aumenta la posibilidad de unión no específica, es decir, mayores son los falsos positivos. Por lo tanto, es necesario seleccionar una membrana adecuada para el proyecto real según los resultados de las pruebas y encontrar el punto de equilibrio adecuado.
2) Diferencias entre membranas de distintos fabricantes
Esta diferencia se debe principalmente a dos puntos:
1> Al producir membranas, los polímeros y tensioactivos utilizados varían en fuente, tipo y cantidad. Nuevamente, estas dos sustancias generalmente tienen un gran impacto en el rendimiento del procesamiento de membranas. 2>El proceso de tratamiento es diferente.
3. Fórmulas de materias primas biológicas, reactivos y soluciones tampón.
1) Las materias primas biológicas se utilizan como materias primas biológicas para las líneas de CT y se utilizan en diferentes situaciones. breve introducción.
En primer lugar, los anticuerpos monoclonales se unen mejor a las membranas que los anticuerpos policlonales, principalmente porque los anticuerpos policlonales tienen muchos sitios de superficie diferentes y las condiciones óptimas de unión de cada sitio a la membrana son ligeramente diferentes, lo que sin duda aumenta. La dificultad de la optimización. En segundo lugar, cuanto mayor es el peso molecular, más difícil le resulta a la proteína unirse a la materia sólida.
2) Solución tampón
Quizás lo que más preocupa a todos es conseguir una fórmula con un rendimiento excelente, incluyendo solución tampón, solución bloqueadora, etc.
De hecho, no puedo proporcionarte una lista de fórmulas universales. Porque diferentes sistemas de reacción requieren diferentes fórmulas que los respalden, y los sistemas de reacción de diferentes instituciones también son diferentes. Si quieres pescar, primero debes aprender a pescar. Para no engañar a todos, solo proporcionaré ideas sobre las siguientes cuestiones relacionadas con las fórmulas. Explore la receta específica usted mismo.
La composición de la solución tampón generalmente es PBS (u otro sistema tampón) + sustancias activas (para problemas específicos) + ajuste de pH. Después de consultar diversa información previa, mi opinión personal es que el principio de la fórmula es simple y sencillo, y se pueden agregar sustancias activas según sus propias necesidades. Muchas sustancias activas que originalmente era necesario agregar ya no son necesarias gracias a las mejoras en la tecnología de fabricación de películas.
El sistema tampón recomendado es PBS PH7-7.2 0,01 M, que tiene buena adaptabilidad a diversos antígenos y anticuerpos.
Las sustancias activas se enumeran a grandes rasgos de la siguiente manera:
Una pequeña cantidad de NACL puede reducir la intensidad de la señal y eliminar los falsos positivos.
El alcohol orgánico (metanol, alcohol isopropílico, etc.) humedece la película y reduce la electricidad estática transportada por la película, lo que es beneficioso para la unión y el recubrimiento. Personalmente, no lo recomiendo debido a la mejora en la tecnología de producción.
Los tensioactivos (TW20, TX100) pueden aumentar la hidrofilicidad, evitar líneas huecas y aumentar el color.
El azúcar, un agente protector, puede ralentizar el envejecimiento y aumentar la hidrofilicidad.
Ajustar el valor del pH a una determinada posición puede eliminar falsos positivos.
4. Ambiente de la muestra
La humedad ambiental es muy importante para el proceso de deposición de la película. La humedad óptima suele ser del 45 al 65%.
Cuando la humedad es demasiado baja, las cargas estáticas tienden a acumularse en la película y tienden a aparecer motas en la película, lo que resulta en manchas hidrofóbicas durante la prueba. Cuando la humedad es demasiado alta, la acción capilar sobre la película se fortalece y la película puntiaguda puede fácilmente hacer que la línea CT se ensanche o incluso se extienda. Para garantizar la uniformidad de la humedad de la membrana durante el muestreo, la membrana generalmente se coloca bajo esta condición de humedad durante un período de tiempo antes del muestreo.
5. Relación entre el equipo de muestreo y las condiciones de la superficie de la membrana.
Actualmente existen dos métodos de muestreo, a saber, el tipo de película raspada y el tipo de película sin punto de contacto. El tipo de película de punto sin contacto es mejor que el tipo de película raspadora, y el tipo de película raspadora importada es mejor que el tipo de película raspadora nacional.
Debido a que el método de raspado utiliza una manguera para raspar los anticuerpos en la superficie de la membrana, y las propiedades físicas de la membrana en sí son suaves y quebradizas, el tubo de raspado dejará rastros en su superficie. Los raspadores de película importados utilizan mejores materiales y sistemas de control, por lo que los rayones que quedan son más leves, mientras que los instrumentos domésticos son más pobres y los rayones que quedan son más graves. Los rayones pueden formar fácilmente resistencia al complejo cromatográfico marcado con oro, lo que genera falsos positivos. Al mismo tiempo, es probable que ocurran fenómenos extraños. Si hay una línea delgada (línea fantasma) en la línea T durante la ejecución, la línea fantasma desaparecerá después de la ejecución.
6. Ancho de la película y posición del punto de luz
El ancho de la película es generalmente de 18 mm (o 20 mm) y 25 mm, que se utilizan para fabricar tiras reactivas y placas reactivas, respectivamente. Sin embargo, diferentes posiciones de muestreo de la línea T traerán diferentes sensibilidades. Cuando la posición del punto se mueve hacia arriba, la velocidad del compuesto marcado con oro que pasa a través de la posición de la línea T se ralentiza, el tiempo de reacción aumenta y la sensibilidad aumenta. Por el contrario, la sensibilidad disminuye. Este método se puede utilizar para variar la sensibilidad y eliminar falsos positivos.
7. Difusión de la solución sobre la membrana
Generalmente la cantidad de solución sobre la membrana es de 1 ml/cm. La difusión de la solución sobre la membrana tiende hacia ambos extremos, pulverizando una solución uniforme de anticuerpos. Sin embargo, al secar, la velocidad de secado en el borde de la línea es mayor que en el medio, y los anticuerpos en el medio continuarán difundiéndose hacia ambos lados, por lo que los anticuerpos se acumularán en ambos extremos de la línea después del secado. Generalmente, no afectará sus experimentos. Si encuentra que los extremos de la línea son rojos y el medio es de color claro, debe considerar este problema. Esto se puede solucionar añadiendo sustancias activas como se mencionó anteriormente.
8. Efecto de sellado antes y después de aplicar la película
Las películas compradas a proveedores están básicamente optimizadas y se pueden utilizar directamente. Sin embargo, a menudo nos encontramos con discusiones sobre el cierre. De hecho, el cierre no es lo que todos piensan. Una vez cerrado, todo encajará en su lugar. El viejo problema desapareció y ha vuelto a aparecer un nuevo problema, que es aún más problemático. Lo que intento decir es utilizar los cierres con precaución. Estoy totalmente en contra de la práctica de sellar las películas antes de fijarlas. La razón es que cuando los fabricantes producen membranas, se mezclan varias fórmulas con la pulpa original. Sin embargo, la película debe empaparse en líquido sellador antes de sellarla, lo que inevitablemente alterará la distribución normal del material en la película. Esto causó muchos problemas y redujo la eficiencia del trabajo. También hay fabricantes que no pueden cubrir la película sin sellar. De hecho, se puede solucionar con otros métodos y el sellado debe ser la siguiente prueba.
Hay dos métodos de sellado que utilizo a menudo: sellado de flujo y manipulación del material activo en la almohadilla de muestra. La membrana se sella en puntos fijos y la sustancia activa se convierte en una solución y se rocía en lugares específicos de la membrana. Este método requiere el uso de la boquilla AIRJET de BIODOT, que puede resucitar paneles semiacabados de calidad inferior. Mientras la membrana esté sellada, inevitablemente afectará la estabilidad del producto. El alcance específico del impacto debe juzgarse mediante pruebas de estabilidad.
9. Almacenamiento de membranas
Las membranas recién producidas suelen contener entre un 5 y un 10 % de humedad. El mecanismo de envejecimiento de las membranas está teóricamente respaldado pero es controvertido. Teóricamente, el envejecimiento de la membrana se debe a la evaporación del agua en la membrana, lo que hace que la membrana sea hidrofóbica, cargada y quebradiza. Por lo general, es necesario que las películas de almacenamiento estén protegidas de la luz, selladas y no demasiado secas ni demasiado húmedas. En tales condiciones de almacenamiento, generalmente se puede almacenar durante dos años. Pero si la membrana está sellada, se debe juzgar de acuerdo con las condiciones de prueba específicas. Debido a problemas en el proceso de producción, la sensibilidad de algunas membranas cambiará dentro de un período de tiempo después de su uso. Si ocurre este problema, es necesario dejar la membrana durante un período de tiempo y luego ponerla en producción de prueba una vez que esté estable.
Membrana filtrante de nitrocelulosa
Especificación: 15X20 cm
Tamaño de poro: 0,45 μm
Almacenamiento: sellado a 5-65438 ± 05 ℃, con una vida útil de un año.
Descripción del producto: La apariencia de este producto es blanca y el frente de la película es brillante. Remojar inmediatamente cuando se exponga al agua. Si no es posible el remojo inmediato, se considera inactivo. Si no es posible realizar el muestreo y existen manchas o estructuras pulverulentas en la superficie de la película, se considera defectuosa. Para la electroforesis de transferencia, el tamaño de los poros debe ser 0,22 o 0,45 para garantizar la resistencia de la membrana y reducir la pérdida de penetración.
Las membranas de nitrocelulosa son quebradizas cuando están excesivamente secas pero elásticas cuando están húmedas. Durante el funcionamiento, la habitación debe mantenerse a temperatura normal para evitar un secado excesivo y fragilidad. La membrana de adsorción electrostática de este producto tiene buena hidrofilicidad, tiempo de diafiltración moderado, fuerte adsorción de proteínas, la proteína de la membrana de transferencia está concentrada y no se difunde, la sensibilidad y especificidad del desarrollo del color son altas y el fondo es bajo.