Describa brevemente los principios de la tecnología PCR

El principio de la tecnología PCR: utiliza la ADN polimerasa para separar dos plantillas de ADN a una temperatura adecuada y luego, bajo la acción de cebadores guiados en ambos extremos del ADN plantilla, a través de la catálisis de la ADN polimerasa, los cebadores y las hebras individuales de la Plantilla de ADN El emparejamiento complementario permite que el extremo 5' de cada cebador sintetice una nueva cadena de ADN, lo que finalmente da como resultado dos nuevas moléculas de ADN.

1. Características de la PCR

La PCR se basa en el hecho de que el ADN se desnaturaliza en hebras individuales a 95°C in vitro. A bajas temperaturas (normalmente alrededor de 60 °C), los cebadores y las hebras individuales se combinan según el principio de apareamiento de bases complementarias, y luego la temperatura se ajusta a la temperatura de reacción óptima de la ADN polimerasa (aproximadamente 72 °C). El camino desde el fosfato hasta las hebras complementarias se sintetiza en la dirección del pentasacárido (5'-3').

Un instrumento de PCR basado en polimerasa es en realidad un dispositivo de control de temperatura que puede controlar bien la temperatura de desnaturalización, la temperatura de renaturalización y la temperatura de extensión. El principio básico de la tecnología de PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN y su especificidad depende de cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo.

2. Cinco elementos de la reacción de PCR

Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco sustancias principales involucradas en la reacción de PCR, a saber: cebadores (los cebadores de PCR son fragmentos de ADN, ADN en células Los cebadores para la replicación interna son cadenas de ARN), enzimas, dNTP, plantillas y tampones (requiere Mg2+). Hay muchas formas de diseñar cebadores, que están determinados por el propósito de la PCR en el experimento, pero los principios básicos son los mismos.

Parámetros de ciclado de la tecnología PCR:

1. Predesnaturalización

La desnaturalización completa del ADN molde y la activación completa de la enzima PCR son muy importantes para el éxito de la PCR. Se recomienda que el tiempo de calentamiento consulte las instrucciones del reactivo. El tiempo de activación de la enzima Taq no modificada es generalmente de dos minutos. ?

2. Paso de desnaturalización

Generalmente, 95 °C durante 30 segundos son suficientes para desnaturalizar completamente varias secuencias de ADN objetivo en el ciclo. Si es posible, se puede acortar el tiempo de este paso. . Si el tiempo de desnaturalización es demasiado largo, la actividad enzimática se dañará. Si el tiempo de desnaturalización es demasiado corto, la secuencia objetivo no se desnaturalizará por completo, lo que puede conducir fácilmente a un fallo de amplificación.

3. Recocido del imprimador

La temperatura de recocido debe determinarse desde muchos aspectos. Generalmente, la temperatura de hibridación se reduce apropiadamente según el valor de Tm del cebador y la longitud de amplificación. Luego haz una estimación basada en este experimento. La temperatura de recocido tiene un gran impacto en la especificidad de la PCR.