Documento de ingeniería biotecnológica
Este artículo presenta principalmente el concepto de ingeniería genética, el proceso general de desarrollo de fármacos utilizando tecnología de ingeniería genética y fármacos de ingeniería genética, y analiza la dirección de desarrollo futuro de la investigación sobre el desarrollo de fármacos utilizando tecnología de ingeniería genética.
Texto:
1 Descripción general de la ingeniería genética
La llamada ingeniería genética se refiere a la inserción de moléculas de ácido nucleico en virus, plásmidos u otras moléculas vectoriales in vitro. Para formar una nueva combinación de material genético se añade a una célula huésped que previamente no tenía esta molécula, lo que le permite reproducirse de forma continua y estable.
La primera característica importante de la ingeniería genética es la capacidad de cruzar la barrera natural de las especies, es decir, poder poner los genes de cualquier organismo en las células de un nuevo organismo huésped que no esté relacionado con él. . Esto demuestra que es posible que los humanos creen nuevas especies que no existen en la naturaleza según sus propios deseos subjetivos. La segunda característica es que enfatiza la amplificación de un pequeño fragmento de ADN en una nueva célula huésped, de modo que se puedan preparar grandes fragmentos de ADN purificados, ampliando así el campo de la biología molecular y haciéndolo útil en el campo de la biofarmacéutica. .
Desde la llegada de la ingeniería genética a principios de la década de 1970, se han logrado logros sorprendentes tanto en la investigación teórica básica como en las aplicaciones prácticas. La determinación y análisis de la secuencia de nucleótidos del genoma completo es un excelente ejemplo de tecnología de ingeniería genética que promueve la investigación biológica básica. El 12 de febrero de 2001, científicos de seis países y el Genoma Humano Internacional publicaron el mapa del genoma humano y los resultados del análisis preliminar, proporcionando a las personas alrededor de 3.000 genes medicinales, lo que promoverá el rápido desarrollo de la industria farmacéutica genética. Debido al desarrollo de la tecnología de clonación de genes, la tecnología de ingeniería genética ha desempeñado un papel importante en la producción industrial, especialmente en la producción farmacéutica. En el pasado, los microorganismos se utilizaban para producir productos útiles, como la penicilina producida por Penicillium y la estreptomicina producida por Streptomyces. Sin embargo, aislar y purificar estos fármacos a partir de estos organismos no sólo es caro sino también técnicamente difícil. Hoy en día, se puede extraer fácilmente una gran cantidad de fármacos útiles mediante la clonación y la transferencia de los genes que codifican estos fármacos a organismos adecuados para una expresión eficaz.
2 El proceso general de desarrollo de fármacos utilizando tecnología de ingeniería genética
El uso de tecnología de ingeniería genética para desarrollar un fármaco generalmente requiere los siguientes pasos: ① Obtener el fragmento del gen objetivo: mediante síntesis química de ADN. se pueden sintetizar fragmentos con secuencias de nucleótidos conocidas; también se pueden extraer y aislar de tejidos biológicos y células de organismos eucariotas para establecer bibliotecas de ADNc. ② Amplifique el fragmento del gen objetivo obtenido y conéctelo a un vector apropiado, luego introdúzcalo en un sistema de expresión apropiado. ③En condiciones de cultivo adecuadas, el gen diana puede expresar el fármaco diana en grandes cantidades en el sistema de expresión. ④ Extraer, separar y purificar el fármaco objetivo y luego preparar la preparación correspondiente.
La mayoría de los métodos anteriores utilizan microorganismos o células de tejido como sistemas de expresión, y producen fármacos mediante fermentación microbiana o cultivo de células de tejido. En los últimos años, las "fábricas biofarmacéuticas" que producen medicamentos a través de animales genéticamente modificados se han convertido en el campo más activo de investigación con animales genéticamente modificados y la industria más atractiva para los productos farmacéuticos genéticamente modificados. Los medicamentos para animales transgénicos tienen las ventajas de un bajo costo de producción, un ciclo de inversión corto, un alto nivel de expresión, completamente consistentes con los productos naturales y un fácil aislamiento y purificación. , especialmente adecuado para algunos factores sanguíneos con grandes dosis y estructura compleja, como la hemoglobina humana (Hb), la albúmina humana (HSA) y la proteína C (Proteína C). La empresa farmacéutica británica Edimburgo utiliza ovejas genéticamente modificadas para producir α1-antitripsina (α1-AAT) para el tratamiento del enfisema. Produce 16 g de AAT por litro de leche de cabra, lo que representa el 30% del contenido de proteínas de la leche. Se estima que cada oveja lactante puede producir 70 gramos de AAT. Además, los medicamentos vegetales modificados genéticamente son más seguros que los medicamentos animales modificados genéticamente, que pueden contaminar patógenos humanos. Se han desarrollado muchos fármacos vegetales modificados genéticamente, como las encefalinas, el interferón-α y la albúmina sérica humana, así como los dos fármacos más caros, la glucocerebrosidasa y el factor de colonias de granulocitos y macrófagos.
3 tipos de medicamentos genéticamente modificados
Desde finales de la década de 1970, los medicamentos genéticamente modificados se han desarrollado rápidamente. En 1978, Escherichia coli se utilizó por primera vez para producir hormonas cerebrales humanas e insulina humana expresadas genéticamente sintéticas. En 1980, la Corte Suprema de Estados Unidos dictaminó que la ingeniería genética microbiana podía patentarse. En 1982, se aprobó el uso de insulina, el primer fármaco producido por bacterias genéticamente modificadas, en Estados Unidos y el Reino Unido. Desde su aprobación, se han multiplicado varios medicamentos genéticamente modificados.
La investigación, el desarrollo y la industrialización de tecnología médica de China también han logrado grandes avances.
(1) La producción tradicional de antibióticos se obtiene principalmente mediante síntesis química o fermentación microbiana. Durante el proceso de producción, el nivel de expresión de la cepa bacteriana es bajo, el costo de producción es alto y es probable que se desarrollen bacterias resistentes a los medicamentos durante su uso. La tecnología de ingeniería genética se puede utilizar para modificar genéticamente las cepas de producción para obtener cepas con altos niveles de expresión y productos altamente específicos, como la penicilina ftalamidasa producida por E. coli. Un equipo de investigación alemán utilizó ingeniería genética para mejorar la actividad de la penicilina amidasa de E. coli. La actividad enzimática de la cepa formada mediante la clonación del plásmido del gen PBR322 de E. coli aumentó 50 veces en comparación con la cepa inicial, mejorando así la capacidad de producción de 6APA. Wang Yiguang de nuestro país utilizó tecnología de recombinación genética para transformar las bacterias productoras de espiramicina, lo que mejoró la expresión de los genes de propioniltransferasa en las bacterias productoras de espiramicina y aumentó la producción de propionilspiramicina.
(2) Existen una serie de péptidos activos en el cuerpo humano, como las hormonas, que tienen un contenido bajo pero tienen una alta actividad fisiológica y tienen un importante efecto regulador sobre el metabolismo humano. Estas sustancias pueden usarse clínicamente como medicamentos para tratar enfermedades causadas por desequilibrios en dichas sustancias. Las preparaciones de estos medicamentos se derivan en su mayoría de diversos órganos animales y los métodos de producción son complejos y costosos. Los productos individuales deben extraerse de cadáveres de animales, lo que imposibilita la producción industrial a gran escala. Desde el surgimiento de la tecnología de ingeniería genética, la producción de microorganismos mediante tecnología de recombinación genética es uno de los mayores logros de la tecnología de ingeniería genética. A continuación se muestran dos medicamentos típicos de este tipo.
Insulina: En 1978, Genentech utilizó la tecnología de recombinación genética y Goeddel y otros estudiosos desarrollaron el uso de E. coli para producir insulina humana. Con el desarrollo continuo de la tecnología de ingeniería genética, el proceso y la tecnología para producir insulina se han mejorado continuamente y han reemplazado por completo los productos extraídos de órganos animales en la práctica clínica. En la actualidad, las ovejas transgénicas en Xinjiang, mi país, han podido expresar con éxito la proinsulina humana, lo que ha abierto una nueva vía para la producción de insulina.
Hormona del crecimiento: La hormona del crecimiento humano se utiliza clínicamente para tratar el enanismo y la distrofia muscular. El método de fabricación tradicional consiste en extraerlo de la glándula pituitaria humana. La fuente de materias primas es difícil y la producción es muy limitada. Sólo el 1% de los pacientes con enanismo en el mundo pueden ser tratados porque la hormona del crecimiento es extremadamente cara, llegando a costar hasta 5.000 dólares por gramo. En 1979, Genentech desarrolló y produjo por primera vez la hormona del crecimiento humano utilizando Escherichia coli por Goeddel y otros académicos. En los últimos años, también se ha desarrollado levadura para producir auxina, con un rendimiento de 1,4×106 ~ 4,7×106 moléculas/célula. En la actualidad, la hormona del crecimiento humano genéticamente modificada de mi país se ha desarrollado con éxito y se ha comercializado para uso clínico.
Además de los fármacos mencionados anteriormente, también existen el factor de crecimiento nervioso (PDGH), el factor de crecimiento de fibroblastos basales humanos y la gonadotropina coriónica producida mediante tecnología de ingeniería genética.
(3) La tecnología de ingeniería genética de factores reguladores inmunológicos celulares se ha utilizado ampliamente en la regulación inmunológica y antitumoral clínica. En los últimos años, debido al progreso de la recombinación genética y la fusión celular, así como a la mejora de la cromatografía líquida de alta presión, los equipos de escisión de secuencias de aminoácidos y la tecnología de análisis de purificación de proteínas, se ha impulsado la investigación y el desarrollo de algunas sustancias activas que regulan la inmunidad celular. se han desarrollado rápidamente, como el interferón (INF), la interleucina (IL), el factor estimulante de colonias (CSF) y el factor de necrosis tumoral (TNF).
El interferón es un producto con amplia investigación, tecnología madura e industrialización temprana. Los interferones de primera generación se extrajeron de la sangre. Según K Canted en Finlandia, el interferón con una pureza inferior al 65.438+0% puede producir menos de 65.438+000 mg después de procesar 23.000 litros de sangre, por lo que el rendimiento es muy bajo. Y como no se puede garantizar la calidad de la fuente de sangre, puede provocar la propagación de enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre. Los interferones de segunda generación se producen mediante tecnología de ingeniería genética. Su nivel de producción puede alcanzar las 250.000 moléculas/célula, y cada litro puede contener 250 millones de unidades. El costo se reduce significativamente y la pureza del producto es muy alta, con un contenido que alcanza más del 90%. Actualmente, se comercializan tres tipos de interferones modificados genéticamente: α, β y γ, y la tecnología de producción se mejora constantemente. Los científicos rusos construyeron un sistema de expresión utilizando Pseudomonas como vector para producir interferones genéticamente modificados. En comparación con los sistemas de expresión tradicionales de E. coli, el ciclo de cultivo es más corto y las células son fáciles de alterar y extraer. Con el desarrollo continuo de la tecnología de recombinación de genes, algunos investigadores han modificado genes de interferón y construido genes de interferón y vectores de expresión específicos.
Xia et al. utilizaron endonucleasas de restricción para cortar los genes diana de plásmidos que contienen anticuerpos monocatenarios del antígeno B S anti-hepatitis humana e interferón α humano respectivamente, y los conectaron al plásmido pET22b para construir un vector de expresión de interferón dirigido a anticuerpos monocatenarios. , y se expresa con éxito en E. coli.
(4) Vacuna Las vacunas tradicionales son sustancias atenuadas o inactivadas de microorganismos patógenos, pero estas vacunas no son ideales y pueden sufrir mutaciones de reversión para restaurar la toxicidad o la enfermedad epidémica; causado por una inactivación inadecuada. Las nuevas vacunas producidas mediante tecnología de ingeniería genética pueden superar las deficiencias de las vacunas tradicionales, como el alto precio y la escasa seguridad, y pueden proporcionar un tratamiento eficaz para algunas enfermedades especiales, como el SIDA, para las que actualmente no existe una vacuna eficaz.
La primera vacuna genéticamente disponible disponible comercialmente fue contra el virus de la hepatitis B humana (VHB). Alrededor del 65.438+00% de la población de China ha sido infectada por el VHB, y la infección por el VHB suele estar estrechamente relacionada con un tipo especial de cáncer de hígado (CHC). Alrededor de 300.000 pacientes en todo el mundo mueren a causa del CHC cada año. El VHB tiene una alta especificidad de huésped y sólo puede infectar a humanos y chimpancés, lo que significa que sólo se puede obtener una cantidad limitada del virus de pacientes con hepatitis para utilizarlo como vacuna, y las vacunas extraídas de la sangre de los pacientes también pueden infectar el SIDA. La vacuna contra el VHB producida mediante tecnología de ingeniería genética supera las deficiencias de las vacunas tradicionales, tiene alta calidad, buena seguridad y una dosis pequeña. La dosis general es inferior a 10 mg y se inocula tres veces, lo que supone una milésima parte de la dosis de los medicamentos habituales. En 1982, P. valenzuela y otros clonaron un fragmento del gen S (gen del antígeno de superficie del VHB) en un vector. Como resultado, se sintetizaron partículas del antígeno de superficie del VHB (HbsAg) en levadura con un rendimiento de 25 μg/L. Ahora los sistemas de expresión en levadura han permitido la producción a gran escala de vacunas contra la hepatitis recombinantes humanas.
Hace unos 20 años, se descubrió que el ADN "desnudo" inyectado en el cuerpo podía inducir una respuesta inmune. Los científicos han realizado muchas investigaciones y han desarrollado un nuevo tipo de vacuna de ácido nucleico. La llamada vacuna de ácido nucleico se refiere a la transferencia directa de genes extraños (ADN o ARN) que codifican proteínas antigénicas a animales y a la síntesis de proteínas antigénicas a través del sistema de expresión del huésped, induciendo así al huésped a producir una respuesta inmune al antígeno. proteínas para lograr el propósito de prevenir y tratar enfermedades. Se han desarrollado una variedad de vacunas de ácido nucleico, como las vacunas de ácido nucleico contra la influenza, las vacunas contra el SIDA, las vacunas contra la rabia, las vacunas contra la tuberculosis, las vacunas contra la hepatitis B y las vacunas contra la hepatitis E.
(5) Productos de terapia génica La terapia génica comenzó a probarse en 1990. En 1993, la FDA de EE. UU. definió la terapia génica humana como "tratamientos médicos basados en cambios en el material genético de células vivas que pueden realizarse in vitro y luego aplicarse al cuerpo humano, o realizarse directamente en el cuerpo humano". Por lo tanto, existen dos métodos de terapia génica, a saber, el método ex vivo y el método in vivo. El método indirecto in vivo selecciona principalmente células que pueden expresar genes extraños mediante la transferencia de genes in vitro y luego las transfiere al cuerpo. El método in vivo cambia y repara directamente el material genético del cuerpo; Con el desarrollo de la biología molecular y la tecnología de recombinación de genes, los métodos para obtener genes diana han madurado, pero el sistema de transferencia y entrega, la regulación de la expresión, la eficacia y la seguridad de los genes diana aún necesitan más investigación y confirmación. En la actualidad, los sistemas de transferencia de genes se dividen en dos categorías: una son los sistemas de transferencia de genes mediados por virus, que incluyen principalmente vectores de retrovirus (Rt), adenovirus (Ad), virus del herpes (HSV) y virus adenoasociados (AAV). Nnldini et al. desarrollaron un vector Rt recombinante basado en el VIH que puede infectar una variedad de células que no se dividen sin células auxiliares y al mismo tiempo conserva la capacidad de integrarse en el cromosoma del huésped. El primer vector de terapia génica del mundo es el vector Rt, que se utiliza para tratar la inmunodeficiencia combinada grave (ADA-SCID) causada por la deficiencia de adenilato descarboxilasa. El otro tipo son los sistemas de transferencia de genes no mediados por virus, incluidos liposomas, vectores de acoplamiento molecular, pistolas de genes y ADN desnudo.
Además, la tecnología de nucleótidos antisentido también se utiliza en terapia génica, especialmente para el virus de la hepatitis B, incluyendo ADN antisentido, ARN antisentido y ARN ribozima. En 2001, Robaczewska et al. administraron ADN antisentido por vía intravenosa por primera vez para inhibir selectivamente la replicación y expresión del VHB en el hígado de patos de Pekín, demostrando la eficacia del ADN antisentido en experimentos con animales. La empresa estadounidense Viagene ha desarrollado un "preparado inmunológico contra el VIH", que es un producto combinado de retrovirus de ratón y secuencias de genes codificantes de proteínas centrales y ARN del antígeno de superficie del VIH. Se ha confirmado en experimentos con ratones y primates que el fármaco puede inducir un VIH fuerte. -células asesinas específicas.
4 Conclusión
La tecnología de ingeniería genética ha provocado cambios fundamentales en el desarrollo de fármacos. La forma tradicional de desarrollo de fármacos es examinar aleatoriamente una gran cantidad de sustancias sintetizadas químicamente y metabolitos microbianos para obtener los ingredientes activos de nuevos fármacos. El uso de la tecnología de ingeniería genética para desarrollar nuevos medicamentos consiste en encontrar los ingredientes activos y sus genes codificantes que puedan usarse con fines terapéuticos mediante la investigación del mecanismo patogénico, y luego transferirlos a vectores apropiados mediante recombinación genética para que los ingredientes activos puedan expresarse en grandes cantidades como fármaco de tratamiento. Al mismo tiempo, la tecnología de ingeniería genética ha traído cambios revolucionarios a la tecnología de producción de medicamentos. Algunos productos que antes eran difíciles de producir, como hormonas, enzimas, anticuerpos y otras sustancias bioactivas, pueden producirse en áreas de alta calidad y alto rendimiento mediante ingeniería genética. Al mismo tiempo, el costo de producción se reduce considerablemente. , mejorando los niveles de medicación y la calidad de vida de los pacientes.
La tecnología de ingeniería genética proporciona nuevos medios eficaces en el diagnóstico, tratamiento y prevención del cáncer, el SIDA, enfermedades genéticas y otras enfermedades que no pueden tratarse eficazmente con la medicina tradicional, y ha logrado algunos avances importantes. Si se descubren oncogenes, será posible el diagnóstico precoz del cáncer y el desarrollo de fármacos terapéuticos. Con el desarrollo de la biología molecular y la tecnología de recombinación genética, creemos que en un futuro próximo, estas enfermedades que ponen en grave peligro la vida humana serán prevenidas y tratadas de forma eficaz.