Introducción a la reacción en cadena de la polimerasa
2 Referencia en inglés Reacción en cadena de la polimerasa [WS/T 455—2014 Terminología de evaluación y monitoreo de la salud]
PCR [WS/T 455—2014 Terminología de evaluación y monitoreo de la salud]
3 Definición de la reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se refiere a un método de detección que utiliza cebadores para amplificar selectivamente fragmentos de ADN o ARN in vitro [1]. Este método se puede utilizar para la tipificación sanguínea, la compatibilidad con trasplantes de médula ósea y la detección de patógenos de enfermedades transmitidas por transfusiones en el campo de las transfusiones de sangre [1].
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método experimental de biología molecular que sintetiza enzimáticamente fragmentos de ADN específicos in vitro. Consta principalmente de tres ciclos térmicos repetidos de desnaturalización a alta temperatura, recocido a baja temperatura y extensión de temperatura adecuada. . Es decir, el ADN molde se desnaturaliza primero en una sola hebra a alta temperatura y se utiliza la ADN polimerasa para hibridar los dos cebadores con las secuencias complementarias en las dos hebras de ADN molde a una temperatura adecuada, luego, bajo la catálisis de la ADN polimerasa. , cuatro tipos de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) son cebadores después de la extensión y el recocido del sustrato. Repetidamente, el fragmento de ADN entre dos secuencias conocidas se amplifica geométricamente. [2]
4 Revisión histórica de la reacción en cadena de la polimerasa 4.1 La primera idea de amplificación de ácido nucleico in vitro fue propuesta por Kolanna y sus colegas en 1971: "Después de la desnaturalización del ADN, utilizando cebadores apropiados mediante hibridación, extendiendo "El cebador con ADN polimerasa y siguiendo el proceso, se puede clonar el motivo de ARNt". Sin embargo, en ese momento era difícil secuenciar y sintetizar cebadores oligonucleotídicos. En ese momento (1970), Smith y otros descubrieron las endonucleasas de restricción del ADN, que permitieron clonar genes in vitro, por lo que las primeras ideas de Kolanna y otros fueron olvidadas. .
4.2 La invención de la reacción en cadena de la polimerasa No fue hasta 1985 que Mullis inventó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que hizo época, en el Laboratorio de Genética Humana de PECetus Company en los Estados Unidos, permitiendo a las personas amplificar infinitamente fragmentos de ácido nucleico in vitro los sueños se hacen realidad. Su principio es similar a la replicación del ADN in vivo, pero proporciona las condiciones adecuadas para la síntesis de ADN in vitro en tubos de ensayo. En primer lugar, se utilizó el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli para amplificar fragmentos específicos del genoma humano. Debido a que la enzima no es resistente al calor, la enzima Klenow debe agregarse nuevamente después de cada calentamiento de ADN desnaturalizado. El proceso requiere mucho tiempo, es laborioso y es propenso a errores cuando se trabaja con varias muestras. La aplicación de la ADN polimerasa termoestable hizo que las reacciones de PCR fueran más fáciles de automatizar, y luego PECetus lanzó el primer termociclador de PCR, haciendo realidad la automatización de esta tecnología. Mullis et al. ganaron el Premio Nobel en 1993 por esta tecnología.
El desarrollo de tecnologías relacionadas con la reacción en cadena de la polimerasa La velocidad de desarrollo de la PCR y tecnologías relacionadas es asombrosa. El primer y segundo Simposio de Tecnología PCR se celebraron en Estados Unidos y Reino Unido en 1988 y 1990 respectivamente. La primera sesión discutió principalmente la aplicación de la PCR y la optimización de la tecnología en sí; el tema principal de la segunda sesión fue los últimos avances del Proyecto Genoma Humano y la PCR. Esto refleja plenamente la importancia que los biólogos conceden a la PCR.
(Tabla) Tecnologías relacionadas de la reacción en cadena de la polimerasa
El objetivo principal del nombre es amplificar fragmentos de genes desconocidos mediante la amplificación de cebadores degenerados
La PCR anidada mejora la sensibilidad y especificidad de la PCR y analiza mutaciones.
La PCR múltiple detecta simultáneamente múltiples mutaciones o patógenos.
Las secuencias desconocidas en ambos lados de la secuencia conocida se amplifican mediante PCR inversa, lo que da como resultado mutaciones del producto.
Amplificación por PCR de ADN genómico desconocido con un único cebador específico
Amplificación por PCR de ADNc desconocido con cebadores unilaterales de una secuencia conocida
Análisis por PCR de anclaje de secuencias en diferentes extremos
Coopera con la PCR para reducir los dímeros de cebador y mejorar la especificidad de la PCR.
La PCR inmovilizada facilita el aislamiento del producto
La PCR unida a membrana elimina impurezas contaminantes o residuos de productos de PCR
Genera proteínas sintéticas o mutadas a través de fragmentos de ADN de PCR en casetes de expresión.
Análisis de metilación del ADN, mutagénesis y clonación mediante PCR mediada por ligación.
RACEPCR amplifica los extremos del ADNc
La PCR cuantitativa cuantifica ARNm o genes cromosómicos.
La PCR in situ se utiliza para estudiar la proporción de células que expresan genes.
Identificación de efectos bacterianos o genéticos mediante PCR putativa
PCR con cebador universal para amplificar genes de interés o detectar patógenos de interés
Amplificación de mensajeros, mapeo fenotípico y mapeo de células pequeñas números Análisis simultáneo de ARNm.
6 Con el desarrollo de otras tecnologías de amplificación y la PCR y tecnologías relacionadas, constantemente nacen nuevas tecnologías de amplificación. Cada una de estas tecnologías tiene sus propias ventajas y desventajas, se complementan entre sí con la PCR y algunas también se pueden utilizar en combinación. * * * El isomorfismo se ha convertido en una gran familia de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos in vitro. Creemos que con el desarrollo de la tecnología de biología molecular aparecerán nuevos miembros de esta familia.
Otra tecnología de amplificación de ácidos nucleicos in vitro (tabla) utiliza el sistema de amplificación dependiente de la transcripción (TAS) para detectar la reacción en cadena de la ligasa (LCR) del VIH para detectar mutaciones puntuales y el sistema de replicación de secuencia autónoma (3SR). para estudiar el ARN. La aplicación clínica, la detección forense y de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la identificación de genes. El sistema de replicasa Qβ aumenta la sensibilidad de detección de la sonda y la reacción cíclica de la sonda aumenta la sensibilidad de detección de la sonda en 6,1. (1) La reacción en cadena de la ligasa (LCR) es una nueva tecnología de detección y amplificación de ADN in vitro, que se utiliza principalmente para la investigación de mutaciones puntuales y la amplificación de genes diana. Fue diseñado e inventado por Backman en 1997 para detectar mutaciones puntuales en secuencias de genes diana y fue patentado.
El principio básico de LCR es el uso de ADN ligasa. Los fragmentos de ADN de doble cadena se conectan específicamente y la secuencia del gen objetivo se amplifica en grandes cantidades mediante ciclos repetidos de tres pasos de desnaturalización, hibridación y ligación.
La eficacia de amplificación de LCR es similar a la de PCR. El uso de ligasa termoestable para realizar LCR solo requiere dos ciclos de temperatura, desnaturalización a 94 °C min, renaturalización y ligadura a 65 °C y aproximadamente 30 ciclos. La detección de sus productos también es cómoda y sensible. Actualmente, este método se utiliza principalmente para la investigación y detección de mutaciones puntuales, detección de patógenos microbianos y mutaciones dirigidas, etc. También se puede utilizar para el diagnóstico de polimorfismos y productos de enfermedades genéticas de base única, identificación de especies microbianas e investigación de mutaciones puntuales de oncogenes, etc.
6.2 Amplificación dependiente de secuencia de ácido nucleico (a) Amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), también conocida como replicación de secuencia autosostenida (3SR) o tecnología de replicación de secuencia de recrecimiento. Esta técnica fue reportada por primera vez en 1990 por Guatelli et al.
NASBA se utiliza principalmente para la amplificación, detección y secuenciación de ARN.
El método básico es el siguiente: añadir cebadores y muestras a la solución de reacción de amplificación, destruir la estructura secundaria de la molécula de ARN a 65°C durante 1 minuto, enfriar a 37°C, añadir transcriptasa inversa, T7 ARN polimerasa y ARNasa H, 37°C Reacciona durante 1 a 1,5 horas y el producto será visible en electroforesis en agarosa y tinción con bromuro de etidio.
NASBA se caracteriza por su funcionamiento sencillo, no requiere equipo especial y no hay ciclo de temperatura. Todo el proceso de reacción está controlado por tres enzimas, con menos ciclos, alta fidelidad, mayor eficiencia de amplificación que la PCR y buena especificidad.
6.3 Sistema de amplificación dependiente de la transcripción (a) Kwen et al. informaron sobre el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS) en 1989, que se utiliza principalmente para amplificar ARN.
La característica principal de TAS es su alta eficiencia de amplificación, porque su número de copias de ARN aumenta exponencialmente en 10. TAS solo necesita 6 ciclos de secuencias objetivo y el número de copias puede alcanzar 2×106. Otra característica de TAS es su alta especificidad. Debido a que TAS sólo puede soportar seis ciclos de temperatura, tiene baja miscibilidad y alta hibridación con perlas de dextrano.
Aunque este método tiene una alta especificidad y sensibilidad, su proceso de ciclo es complicado y requiere la adición repetida de transcriptasa inversa y ARN polimerasa T7, lo que necesita más investigación.
6.4 Reacción de replicasa Qβ (A) Cassin es igual a 1972. Se informó por primera vez que la replicasa Qβ cataliza la función de autorreplicación del molde de ARN y puede amplificar su molde natural de ARN MDV1 a 109 en 30 minutos a temperatura ambiente. En 1986, Chu et al. informaron que las sondas específicas de secuencia objetivo con biomarcadores podían hibridarse con el ARN MDV1 unido a avidina. Después de la elución del MDV1 no unido, se agrega Qβ replicasa para amplificar y replicar una copia de MDV1, que luego se detecta mediante tinción con bromuro de etidio o se hibrida con una segunda sonda de la misma fuente.
La replicasa Qβ es una ARN polimerasa guiada por ARN con tres características: ① Puede iniciar la síntesis de ARN sin la guía de cebadores oligonucleotídicos. ②Puede reconocer específicamente la estructura de plegamiento de ARN única formada por el emparejamiento de bases intramoleculares en genes de ARN. ③Inserte una secuencia corta de ácido nucleico en la región estructural desplegada del ARN MDV1 plantilla natural de la replicasa Qβ, que no afecta la replicación de la enzima. Por lo tanto, si se inserta una sonda de ácido nucleico en esta región, su secuencia puede amplificarse mediante la Qβ replicasa.
Lizardi et al., 1988, utilizaron la ARN polimerasa T7 para transcribir la sonda de ARN MDV1 a partir de la secuencia del gen diana ***plásmido MDV1. Este tipo de sonda de ARN puede hibridarse con la secuencia objetivo, luego lavar la sonda no hibridada, agregar Qβ replicasa para amplificar la sonda y la sonda amplificada puede usarse como plantilla para la amplificación exponencial. Utilice los dos métodos anteriores para probar el producto. Esta tecnología ahora ha evolucionado para incluir hibridación tipo sándwich, interruptores moleculares y replicación dependiente de objetivos.
Ejemplos de aplicación de la tecnología PCR: Investigación: clonación de genes; secuenciación de ADN; análisis de mutaciones; recombinación y fusión de genes; identificación y regulación de secuencias de ADN de unión a proteínas; detección de modificaciones de genes; construcción de genes sintéticos; construcción de vectores de clonación o expresión; detección de polimorfismos de endonucleasas genéticas
Diagnóstico: bacterias (espiroquetas, micoplasmas, clamidia, micobacterias, rickettsias, difteria, Escherichia coli patógena, disentería Shigella, Aeromonas hydrophila, Clostridium difficile, etc.); virus (HTLV, VIH, HBV, HPV, EV, CMV, EBV, HSV, virus del sarampión, rotavirus y parvovirus b 19) (malaria, etc.); , talasemia, hemofilia, DMO, DMD, fibrosis quística, etc.)
Inmunología: segmentación de HLA; análisis cualitativo del receptor de células T o mapeo de genes de enfermedades autoinmunes; p>Ingeniería del Genoma Humano: generación mediante propagación de secuencias repetitivas de marcadores de ADN; construcción de mapas genéticos (detección de ADN, polimorfismos o mapeo ***); construcción de mapas físicos, elaboración de perfiles de expresión;
Ciencias Forenses: Análisis de muestras de la escena del crimen; Hladik
Tumores: cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, melanoma, neoplasias malignas hematológicas.
Biología de tejidos y poblaciones: investigación sobre agrupaciones genéticas; investigación sobre conservación de animales; ecología; patrimonio experimental.
Paleontología: Arqueología y análisis de ejemplares de museos
Zoología: Diagnóstico de enfermedades infecciosas animales, etc.
Botánica: Detección de patógenos vegetales, etc.
8 Principios y conceptos básicos de la PCR 8.1 Principios básicos La replicación del ADN en las células es un proceso complejo. Los factores básicos involucrados en la replicación son: ADN polimerasa, ADN ligasa, plantilla de ADN, cebadores de ARN que inician la síntesis de enzimas, materias primas de nucleótidos, iones inorgánicos, pH apropiado y algunas enzimas y factores proteicos que desenrollan las estructuras de ADN superenrolladas y bicatenarias. .
La PCR es una reacción de replicación del ADN en un tubo de ensayo. Los principios básicos son similares a los del cuerpo. La diferencia es que la enzima Taq resistente al calor reemplaza a la ADN polimerasa y el cebador de ADN sintético reemplaza al cebador de ARN. Al cambiar la temperatura, como calentamiento (desnaturalización), enfriamiento (recocido y aislamiento (extensión)), el ADN puede. El proceso específico de la PCR es el siguiente: cuando el sistema de reacción de la PCR se calienta a aproximadamente 95 °C, se puede copiar y el ADN se puede desnaturalizar, hibridar y extender repetidamente. Se desagrega en dos hebras simples, lo que ocurre por desnaturalización. Reduce la temperatura por debajo del valor Km del cebador, y los cebadores en los extremos 3' y 5' se unen respectivamente a las regiones complementarias de las dos plantillas de ADN monocatenario. se llama recocido.
Cuando la temperatura del sistema de reacción aumenta a aproximadamente 70 °C, la ADN polimerasa Taq termoestable cataliza la adición secuencial de cuatro desoxinucleótidos al extremo 3' del cebador según el patrón complementario de la secuencia de nucleótidos del ADN molde para formar un nuevo ADN. cadena. . Cada ciclo duplica el número de moléculas de ADN en el sistema de reacción. En teoría, aumentará a 2n veces después de algunos ciclos. Después de 30 ciclos, el rendimiento de ADN alcanza 2·30 copias, lo que equivale aproximadamente a 10·9 copias. El proceso de amplificación por PCR se muestra en la Figura 81. De hecho, la eficiencia de amplificación es menos de 2 veces, por lo que debería ser (1+r) n, donde r es la eficiencia de amplificación.
8.2 Factores involucrados en el sistema de reacción de PCR y sus funciones Los factores involucrados en la reacción de PCR incluyen principalmente ácido nucleico molde, cebadores, TaqDNA polimerasa, tampón, Mg2+, trifosfato de desoxinucleótido (dNTP) y temperatura de reacción. Y número de ciclo, instrumento de PCR, etc. Sus funciones se presentan a continuación:
(1) Ácido nucleico molde
El ácido nucleico molde utilizado para la PCR puede ser ADN o ARN. Cuando se utiliza ARN como plantilla, primero se realiza la transcripción inversa para generar ADNc y luego se realiza el ciclo de PCR normal. Las plantillas de ácido nucleico están ampliamente disponibles y pueden extraerse de células cultivadas, bacterias, virus, tejidos, muestras patológicas y muestras arqueológicas.
La cantidad de plantilla de ADN añadida en la reacción de PCR es generalmente de 100.100.000 copias. Actualmente, se pueden preparar bibliotecas de ADNc correspondientes a partir de células individuales. Cantidades adecuadas de plantilla de ADN pueden reducir los desajustes de bases causados por múltiples ciclos de PCR.
Normalmente se utilizan moléculas de ADN lineal como ADN plantilla. Si se trata de un plásmido circular, lo mejor es cortarlo primero en moléculas lineales con una enzima, porque el ADN circular se renaturaliza demasiado rápido.
(2) Cebadores
Los cebadores determinan la especificidad y la longitud de los productos de amplificación por PCR. Por tanto, el diseño del cebador determina el éxito o el fracaso de la reacción de PCR.
Hay dos cebadores en la reacción de PCR, a saber, el cebador del extremo 5' y el cebador del extremo 3'. El cebador del extremo 5' se refiere al oligonucleótido con la misma secuencia que el extremo 5' de la plantilla, y el cebador del extremo 3' se refiere al oligonucleótido que es complementario al extremo 3' de la plantilla. Los requisitos básicos para los cebadores son: ① La longitud del cebador es demasiado corta, lo que afectará la especificidad de la PCR. Necesita 1630 pb, porque 4 164,29 x 10 9 es más grande que el genoma de los mamíferos 3x10 ^ 9 pb, lo que garantiza una unión específica; El cebador es demasiado largo, la temperatura de extensión excederá la temperatura óptima de la ADN polimerasa Taq (74 grados) y también afectará la especificidad del producto. ②El contenido de G+C es generalmente del 40% al 60%. ③Las cuatro bases deben distribuirse aleatoriamente y no debe haber más de tres purinas o pirimidinas idénticas consecutivas. Especialmente en el extremo 3' del cebador, no debe haber tres G o C consecutivos; de lo contrario, el cebador y la región rica en G o C del ácido nucleico serán erróneamente complementarios, afectando la especificidad de la PCR. ④El cebador en sí no puede tener una secuencia complementaria, lo que provocará el autoplegamiento. Al menos las bases complementarias continuas del cebador en sí no pueden tener más de 3 pb. ⑤Los dos cebadores no pueden ser complementarios, especialmente sus extremos 3'. No más de 4 bases consecutivas entre un par de cebadores deben ser complementarias para evitar dímeros de cebador. ④ La homología entre el cebador y la región diana no específica no puede exceder el 70% ni tener 8 bases complementarias consecutivas; de lo contrario, se producirá una amplificación no específica. ①El extremo 3' del cebador es el punto donde comienza la extensión. Por tanto, no debería haber ningún desajuste. Debido a la regularidad de los desajustes causados por ATCG, la A en el extremo 3' del cebador tiene el mayor impacto, por lo que se debe evitar en la medida de lo posible la primera base en el extremo 3' del cebador. El extremo 3' del cebador no debe ser la tercera base del codón codificante para evitar afectar la especificidad de la amplificación debido a la degeneración del codón 3. ⑧El extremo 5' del cebador se puede modificar, incluida la adición de sitios de restricción, biotina, sustancias fluorescentes y marcadores de digoxigenina, la introducción de sitios de mutación, la introducción de secuencias promotoras, la introducción de secuencias de ADN de unión a proteínas, etc. El diseño de la imprimación se guía mejor por software de computadora.
En el sistema de reacción, generalmente se requiere que la concentración del cebador esté entre 0,10,5 μmol. Si la concentración es demasiado alta, pueden aparecer fácilmente dímeros de cebador o productos no específicos.
El valor de Tm del cebador está relacionado con la temperatura de recocido y la fórmula de cálculo es Tm4(G+C)+2(A+T). El valor de Tm del cebador debería estar preferiblemente en el intervalo de 5580°C, preferiblemente cerca de 72°C.
(3) TaqDNA polimerasa termoestable
Chien aisló la polimerasa termoestable en 1976, y Erlich aisló y purificó la polimerasa termoestable Tq adecuada para PCR en 1986. La PCR sentó las bases para convertirse en una tecnología práctica y ha sido producido mediante recombinación genética. Recientemente, hay muchos tipos de polimerasas que se pueden usar para la PCR: la enzima Taq extraída de termófilos acuáticos, la enzima Taq obtenida de plántulas termófilas, la enzima VENT aislada de Thermococcus Litoralis y las enzimas Sac ácidas se aislaron de plántulas divididas por vulcanización en baño térmico. entre las cuales las enzimas Taq son las más utilizadas. El peso molecular de la ADN polimerasa Taq es de 94 kD y la actividad específica a 75 ℃ es de 150 bs/molécula de enzima. Si la temperatura de reacción es demasiado alta o demasiado baja, afectará su alargamiento. Los cogollos de TaqDNA tienen una alta estabilidad térmica. Los experimentos muestran que a 92,5 ℃, 95 ℃ y 97,5 ℃, la vida media es de 40 minutos, 30 minutos y 5 minutos respectivamente.
La enzima Taq purificada no tiene actividad exonucleasa 3’5’ in vitro, por lo que no tiene función de corrección de lectura y puede provocar desajustes durante la amplificación. El número de bases no coincidentes se ve afectado por la temperatura, la concentración de Mg2+ y el número de ciclos. Generalmente, la tasa de discrepancia de la enzima Taq después de 30 ciclos es aproximadamente del 0,25%, que es mayor que la de la enzima Klenow. La enzima Taq tiene una tasa de mutación por desplazamiento de marco de 1/30.000 y una tasa de sustitución de bases de 1/8.000 por ciclo. La aplicación de bajas concentraciones de dNTP (20 μ mol/L cada uno), una concentración de Mg2+ de 1,5 mmol/L y una temperatura de renaturalización superior a 55 °C puede mejorar la fidelidad de la enzima Taq, y la tasa promedio de desajuste en este momento es sólo 5x10^ 6 veces/(nucleótido*ciclo).
La enzima Taq tiene una actividad similar a la transferasa terminal TdT y puede añadir una base, especialmente dATP, al extremo 3' del producto bicatenario recién generado. Por lo tanto, hay dos formas de clonar el producto de la PCR en el vector: una es construir un vector dT y la otra es eliminar el terminal 3' A con la enzima Klenow, es decir, después de la reacción de la PCR, calentar a 99°; C durante 10 minutos para inactivar la enzima Taq y ajustar la concentración de Mg2+ a 510 mmol/L, añadir 12 U de fragmento Klenow y retirar el extremo 3' A a temperatura ambiente durante 1520 minutos.
La enzima Taq también tiene actividad de transcripción inversa. Cuando la concentración de Mg2+ es de 23 mmol/L y la temperatura es de 68°C, aparece una actividad similar a la transcriptasa inversa. Si está presente Mg2+, la actividad de transcripción inversa es mejor y esta actividad puede usarse directamente en RNAPCR, especialmente para la amplificación de fragmentos cortos.
En el pasado, cuando se utilizaba la enzima Taq para la amplificación por PCR, sólo se podían amplificar fragmentos de ADN de menos de 400 pb. Tras modificar la estructura y función de la enzima Taq y mejorar la metodología de la PCR, se pueden amplificar fragmentos de ADN de más de 20 kb.
La cantidad de enzima Taq añadida en la reacción de PCR también es muy importante. Demasiado poco no es bueno y demasiado es un desperdicio, lo que lleva a una amplificación no específica. Por lo general, es mejor contener 12,5 U de enzima Taq por 100 μl de solución de reacción. Se determinó que la concentración óptima de enzima estaba dentro del rango de 0,55 U. Otro problema es que aunque la enzima Taq es una enzima herramienta con buena estabilidad térmica, debe almacenarse a 20°C.
(4) Solución tampón
La solución tampón proporciona un pH adecuado y algunos iones para la reacción de PCR, normalmente 1050 mmol/L. Solución tampón TrisHCI (pH 8,38,8). El tampón que contiene 50 mmol/l de KCl es beneficioso para el recocido de cebadores. Algunas personas también añaden albúmina sérica de ternera (100μg/L) o gelatina (0,0%) o Tween 20 (0,05% 0,1%) o ditiotreitol (DDT, 5 mmol/L), pensando que estas sustancias pueden proteger la enzima Taq.
(5)Mg2+La actividad de la enzima Taq requiere Mg2+. Cuando la concentración de Mg2+ es demasiado baja en verano, la actividad de la enzima Taq disminuye significativamente. La concentración de Mg2+ es demasiado alta, lo que hace que la enzima catalice una amplificación no específica. La concentración de Mg2+ también afecta el recocido de los cebadores, las temperaturas de fusión de las plantillas y los productos de la PCR, y la generación de dímeros de los cebadores. La actividad de la enzima Taq solo está relacionada con la concentración de Mg2+ libre, pero en el sistema de reacción de PCR, todos los grupos fosfato en dNTP, cebadores y plantillas de ADN pueden unirse al Mg2+, reduciendo la concentración de Mg2+ libre. Por lo tanto, la cantidad total de Mg2+ debe ser 0,20,25 mmol/L mayor que la concentración de dNTP.
Si el sistema de reacción contiene un agente quelante como EDTA, también se puede combinar una porción de Mg2+.
Para obtener la concentración óptima de Mg2+ se pueden utilizar los siguientes métodos de optimización. Primero, sin agregar Mg2+ al tampón de PCR, agregue una cierta cantidad de Mg2+ de la solución de almacenamiento de Mg2+ de 10 mmol/L configurada a cada tubo de reacción. Inicialmente, el gradiente de concentración aumenta en 0,5 mmol/L (0,5, 1,0, 1,5, 2,0). ,...5,0 mmol/L).
(6) dNTP
DNTP es una materia prima sintética para la reacción de PCR. La concentración de cada dNTP debe ser igual y el rango de concentración habitual es 20200 gmol/L. Dentro de este rango, el equilibrio entre la cantidad de producto de la PCR, la especificidad y la fidelidad de la reacción es el mejor. Por ejemplo, cuando cada dNTP es de 20 µmol/l, teóricamente se pueden producir 2,6 µg de ADN de 400 pb. Mantener la concentración de tetradNTP por encima de su valor Km (1015 μmol/L) mantiene la fidelidad de la incorporación de bases. Si la concentración de dNTP es superior a 50 mol/L, se inhibirá la actividad de la enzima Taq.
(7) Temperatura de reacción y tiempo del ciclo
1. Temperatura y tiempo de desnaturalización
El paso de desnaturalización es muy importante en la reacción de PCR. Si el ADN molde y el producto de la PCR no se pueden desnaturalizar completamente, la reacción de la PCR no será exitosa. Cuanto mayor sea el contenido de G+C en la molécula de ADN, mayor será la temperatura de desnaturalización requerida. Una temperatura y un tiempo de desnaturalización demasiado altos afectarán la actividad de la enzima Taq. La temperatura y el tiempo de desnaturalización habituales son 95 °C y 30 s respectivamente, y en ocasiones se utilizan 97 °C y 15 s. Aunque las cadenas de ADN solo tardan unos segundos en separarse a la temperatura desnaturalizante, el interior del tubo de reacción tarda un poco en alcanzar la temperatura requerida, por lo que el tiempo debe ampliarse adecuadamente. Para garantizar que el ADN molde pueda desnaturalizarse por completo, es mejor configurarlo en 710 minutos y luego establecer el número de pasos de desnaturalización en 95 °C/min en ciclos posteriores.
Al amplificar un fragmento corto de 100300 pb, se puede utilizar un método de PCR rápido de dos pasos, a saber, desnaturalización (9497 °C), hibridación y extensión (5575 °C).
Para evitar que la solución de reacción se evapore a la temperatura de desnaturalización, se pueden añadir 65438±02 gotas de parafina líquida al tubo de reacción.
2. Temperatura y tiempo de renaturalización
La temperatura de renaturalización determina la especificidad de la PCR, y la temperatura de renaturalización adecuada debe ser 5°C inferior al valor de Tm del cebador. La temperatura de hibridación es demasiado baja, lo que da como resultado una amplificación no específica; aumentar la temperatura de hibridación puede mejorar la especificidad de la amplificación, por lo que la temperatura de hibridación debe controlarse estrictamente. El tiempo de reacción de recocido es generalmente de 65438 ± 0 minutos.
Al inicio del primer ciclo de PCR, la reacción comienza a una temperatura muy por debajo del valor de Tm. Dado que la enzima Taq todavía está activa a bajas temperaturas, pueden aparecer productos no específicos o dímeros de cebadores en la interfaz no específica entre los cebadores y los moldes, y luego los productos no específicos se amplifican repetidamente a lo largo de la reacción de PCR, lo que lleva a graves problemas. Fallo de la PCR. Para eliminar esta amplificación no específica tanto como sea posible, se puede utilizar el método de inicio en caliente. Hay varios métodos de inicio en caliente: un método consiste en agregar anticuerpo enzimático anti-Taq al sistema de PCR. La combinación de anticuerpos y la enzima Taq inhibe la actividad de la enzima Taq. Entonces, al principio, aunque la temperatura es baja, los cebadores pueden no coincidir con la plantilla, pero debido a que la enzima Taq está inactiva, no causará una amplificación no específica cuando se realiza la desnaturalización térmica, el anticuerpo se inactiva a alta temperatura y se libera; Enzima Taq, que puede usarse y caracterizarse en pasos de elongación posteriores.
Agregación heterogénea de ADN. Otro método de inicio en caliente es utilizar parafina para separar la enzima Taq del sistema de reacción de PCR, de modo que inicialmente no haya amplificación no específica a temperatura ambiente. Cuando la temperatura aumenta hasta la temperatura de desnaturalización térmica, la parafina se funde y la enzima Taq se mezcla con el sistema PCR negativo para desempeñar un papel en los pasos posteriores. El uso del inicio en caliente puede mejorar la especificidad de la amplificación por PCR.
3. Temperatura y tiempo de extensión
Generalmente la temperatura de extensión ronda los 72°C. En este momento, la actividad de la enzima Taq es de 35.100 nucleótidos por segundo y 1 minuto es suficiente para producir un fragmento de 2 kb. Si el fragmento de ADN es más largo, el tiempo de amplificación se puede ampliar adecuadamente. Los tiempos de extensión prolongados pueden provocar una amplificación inespecífica.
4. Número de ciclos
El número de ciclos depende principalmente de la concentración de la molécula objetivo inicial.
Por ejemplo, cuando las moléculas objetivo iniciales son 3x105, 1,5x104, 1x103 y 50 copias, el número de ciclos puede ser 2530, 3035 y 3540 respectivamente. Demasiados ciclos aumentarán el número de productos no específicos y el número de desajustes de bases. En las últimas etapas de la reacción de PCR, el aumento de productos amplificados no aumenta exponencialmente, lo que se denomina efecto meseta. El efecto de plataforma puede estar relacionado con los siguientes factores: la concentración de dNTP y el cebador disminuye, la proporción de enzima a plantilla disminuye relativamente, la actividad enzimática disminuye después de múltiples ciclos y la desnaturalización es incompleta después de que aumenta la concentración del producto, lo que afecta al cebador. extensión.
(8) Instrumento de PCR
Existen muchos instrumentos de PCR nacionales e importados. Los métodos de calentamiento y enfriamiento del instrumento pueden ser calentamiento de gas, calentamiento de agua y calentamiento de bloque calefactor eléctrico. Parámetros como la temperatura, el número de ciclos y el tiempo ahora están controlados por computadora. Puedes elegir el instrumento según tus necesidades.
Debido a la alta sensibilidad del método PCR, una pequeña cantidad de moléculas objetivo se puede amplificar hasta un número ilimitado. Por lo tanto, en el futuro, es necesario evitar que los productos de amplificación por PCR contaminen el medio ambiente y provoquen falsos positivos en la PCR. Por lo tanto, el proceso de detección de la máquina de PCR y del producto de PCR debe separarse lo más posible de la preparación de muestras y de la preparación del tubo de reacción de PCR, preferiblemente en salas diferentes. Por lo general, el espacio experimental se puede dividir en un área de procesamiento de muestras, un área de preparación de mezcla de reacciones y un área de amplificación por PCR, un área de análisis de productos, etc.
9 Examen de reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa es un método para la amplificación rápida de genes específicos o secuencias de ADN in vitro, por lo que también se denomina amplificación de genes in vitro. La tecnología de PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN y su especificidad depende de cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo.
9.1 El valor normal de la reacción en cadena de la polimerasa significa que los tipos y proporciones de bacterias en el cuerpo son normales y que el cuerpo humano se encuentra en un estado de equilibrio dinámico y salud.
9.2 Importancia clínica de la reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa puede amplificar rápida y específicamente cualquier gen objetivo o fragmento de ADN conocido, y puede iniciar fácilmente el gen objetivo en la mezcla de ADN a nivel de pg. a nanogramos, microgramos y miligramos. Por lo tanto, la tecnología de PCR se ha utilizado ampliamente en diversos campos de la biología molecular desde su aparición.
Resultados anormales: Anomalías provocadas por diversas enfermedades, como la sífilis. ① Sífilis primaria. Es decir, chancro duro, con un período de incubación de 2 a 4 semanas, aparecen bultos duros de color rojo oscuro, úlceras superficiales, dureza similar a un cartílago y ganglios linfáticos inflamados en los genitales externos. ②Sífilis secundaria. Uno o dos meses después de la sífilis primaria, aparecen erupciones generalizadas simétricas, máculas, pápulas, pústulas, etc. en la piel y las membranas mucosas de todo el cuerpo. Pueden aparecer placas mucosas y verrugas planas que son muy contagiosas. ③Sífilis terciaria. Ocurre de 2 a 3 años o incluso 10 años después de la infección, la piel se vuelve gelatinosa y se hincha, y también puede afectar huesos, articulaciones, corazón y vasos sanguíneos. Las principales manifestaciones son arteritis, insuficiencia valvular aórtica y aneurisma aórtico. Y los nervios invadidos incluyen tuberculosis espinal, parálisis general (demencia paralítica), etc.