Método de detección de enzima desencoladora biológica

El componente principal de la enzima desencolante es la α-amilasa. Encontré un método de detección para la α-amilasa.

Método del espectrofotómetro de amilasa resistente a altas temperaturas

1 Principio:

La α-amilasa puede cortar aleatoriamente los enlaces α-1,4-glucosídicos de la cadena del almidón en dextrinas de cadena corta, una pequeña cantidad de maltosa y glucosa, lo que provoca la reacción específica de. El almidón se vuelve negro azulado a yodo. A medida que el almidón se degrada, el color azul se desvanece gradualmente y se vuelve marrón rojizo. La velocidad de desaparición del color está relacionada con la actividad de la enzima, por lo que se puede medir en condiciones estándar después de la reacción. actividad enzimática a partir de la absorbancia de la solución

2 Reactivos y soluciones

1) Solución de yodo original: Pesar 22,0 g de yoduro de potasio y disolverlo en aproximadamente 300 ml de agua, añadir 11,0 g de yodo, y revuelva mientras lo disuelve, luego transfiéralo a un matraz aforado de 500 ml, dilúyalo con agua y guárdelo en una botella marrón para su uso posterior (prepárelo una vez al mes).

2) Solución de yodo diluida: Pesar 20,0 g de yoduro de potasio y disolverlo en 300 ml de agua, añadir con precisión 2,00 ml de la solución de yodo original, transferir todo a un matraz aforado de 500 ml, diluir a volumen con agua, y guárdelo en una botella marrón para su uso posterior (es necesario prepararlo el mismo día).

3) Solución de almidón soluble de 20 g/l: Pesar 2000 g de almidón soluble (en base seca), con una precisión de 0,0001 g, hacer una suspensión con agua y verter lentamente 70 ml de agua hirviendo mientras se agita. Luego , enjuague el vaso pequeño que contiene almidón con 30 ml de agua varias veces, agregue el líquido de lavado, caliente y hierva durante 2 minutos hasta que esté completamente transparente, enfríe a temperatura ambiente, transfiera todo a un matraz aforado de 100 ml y diluya con agua hasta el marca. Esta solución debe prepararse el mismo día.

4) Tampón fosfato (PH=6,0): Pesar 45,23 g de hidrogenofosfato disódico y 8,07 g de ácido cítrico, disolver en agua y diluir a 1000 ml. Después de la preparación, calibrar con un medidor de pH.

5) Solución de ácido clorhídrico c (HCL) = 0,1mol/L

3 Instrumentos y equipos:

a) Espectrofotómetro b) Baño María a temperatura constante. 50 ℃-100 ℃, precisión ±0,1 ℃ c) Tubo de ensayo: 25 mm × 200 mm d) Matraz volumétrico e) Pipeta automática f) Cronómetro

4 Preparación de la solución enzimática a analizar

Preparación de enzima líquida: Preparar directamente con solución tampón para controlar la concentración final dentro del rango de 65-70u/mL.

5 Determinación

1) Tomar 20,0 ml de solución de almidón soluble y 5,0 ml de solución tampón en un tubo de ensayo, precalentarlo y equilibrarlo en un baño de agua a temperatura constante a 70 °C. durante 5 minutos.

2) Agregue 1,00 ml de la solución de enzima diluida a analizar, registre inmediatamente el tiempo con un cronómetro, agite bien y reaccione con precisión durante 5 minutos.

3) Extraiga inmediatamente 1,00 ml de la solución de reacción b) con una pipeta, agréguelo a un tubo de ensayo precargado con 0,5 ml de ácido clorhídrico de 0,1 mol/L y 5,00 ml de solución de yodo diluido, y agitar bien.

4) Utilice una mezcla de 0,5 mL de ácido clorhídrico de 0,1 mol/L y 5,00 mL de solución de yodo diluida como blanco de reactivo. A una longitud de onda de 660 nm, utilice una cubeta de 10 mm para medir rápidamente. absorbancia (A). Verifique de acuerdo con el Apéndice A de absorbancia (apéndice estándar), encuentre la concentración (c) de la solución de enzima medida.

6 Definición de actividad enzimática:

La cantidad de enzima necesaria para licuar 1 mg de almidón soluble en dextrina en 1 minuto en condiciones de 70°C y pH 6,0 es una enzima. unidad de actividad, expresada en u/mL(u/g).

7 Cálculo: X=c×n×16.67

En la fórmula, X------actividad enzimática de la muestra

c-- --- -Concentración de la enzima de prueba

n------Factor de dilución de la muestra

16,67—Constante de conversión

Los resultados se expresan en números enteros .

8 Diferencias permitidas en los resultados

El error relativo de las pruebas paralelas no deberá exceder el 2%.