¿Por qué el método sándwich de doble anticuerpo es el método más utilizado para detectar antígenos?
2) Añadir la muestra a analizar y mantener caliente para que reaccione. El antígeno de la muestra se combina con el anticuerpo en fase sólida para formar un complejo antígeno-anticuerpo en fase sólida.
Lavar para eliminar el resto del material no adherido.
3) Añadir anticuerpo marcado con enzima e incubar la reacción. El antígeno del complejo inmunitario en fase sólida se une al anticuerpo marcado con enzima y el antígeno no unido se lava minuciosamente.
En este momento, la cantidad de enzima transportada en el soporte sólido está relacionada con la cantidad de antígeno en la muestra.
4) Añade sustrato para desarrollar el color. Las enzimas en la fase sólida catalizan el sustrato en productos coloreados. La cantidad de antígeno en una muestra se puede medir mediante comparación de colores.
En ensayos clínicos, este método es adecuado para detectar diversos antígenos macromoleculares como proteínas, como HBsAg, HBeAg,
AFP, hCG, etc. Siempre que se obtenga el anticuerpo contra el antígeno a detectar, se puede utilizar para recubrir el vehículo en fase sólida y preparar la enzima para la conjugación.
Si la fuente del anticuerpo es un antisuero, lo mejor es tomar los anticuerpos de diferentes tipos de animales para recubrirlos y marcarlos con enzimas.
Si se utilizan anticuerpos monoclonales, generalmente se seleccionan dos anticuerpos monoclonales dirigidos a diferentes determinantes del antígeno para recubrir la fase sólida por separado.
Este método sándwich de dos sitios es altamente específico y se puede utilizar para etiquetar la muestra que se va a analizar e incubarla con anticuerpos enzimáticos para una mayor detección.
En el ensayo de un solo paso, cuando el contenido del antígeno detectado en la muestra es alto, el exceso de antígeno se marca con anticuerpos en fase sólida y enzimas respectivamente.
Los anticuerpos se unen y ya no forman un complejo sándwich. Esto es similar al fenómeno del exceso de antígeno en una reacción de precipitación. Cuando se desarrolla la reacción, el valor de absorción (ubicado en el área de exceso de antígeno) y la curva estándar (ubicada en el área de exceso de anticuerpos) tienen una cierta concentración de antígeno.
Los valores de absorbancia son los mismos (ver 1.3.2, Figura 1-4). Si se mide utilizando métodos normales, el resultado será inferior al contenido real.
Para decirlo en sentido figurado, es el efecto gancho, porque la curva estándar se curva hacia abajo en forma de gancho después de alcanzar la cima. El efecto de enganche es grave.
Sin embargo, es posible que la reacción ni siquiera desarrolle color, lo que dará como resultado un resultado falso negativo. Por lo tanto, el contenido de la muestra medido con el reactivo de un solo paso puede ser anormal.
Al añadir sustancias (como HBsAg, AFP en suero, hCG en orina, etc.). ), preste atención al valor más alto en el rango medible.
El uso de anticuerpos monoclonales de alta afinidad para preparar dichos reactivos puede debilitar el efecto gancho.
Si hay múltiples determinantes idénticos en diferentes sitios de la molécula analizada, como el determinante A del HBsAg, también puede darse el caso de que la fase sólida y el recubrimiento del conjugado enzimático estén dirigidos al mismo anticuerpo monoclonal. para esta decisión, pero se debe prestar atención a los subtipos al detectar HBsAg
Pregunta: HBsAg tiene cuatro subtipos: adr, adw, ayr y ayw4, aunque cada subtipo tiene la misma determinación de la reacción.
El género, este también es un tema al que se debe prestar atención cuando se utilizan anticuerpos monoclonales en el método sándwich.
Otro punto a tener en cuenta al utilizar el método sándwich de doble anticuerpo para detectar antígenos es la interferencia del factor reumatoide (FR). RF es un autoanticuerpo, principalmente del tipo IgM, que puede unirse al fragmento Fc de muchas IgG animales. Si la muestra de suero utilizada para la detección de sándwich de doble anticuerpo contiene RF, se puede utilizar como componente antigénico y puede combinarse con anticuerpos en fase sólida y anticuerpos marcados con enzimas al mismo tiempo, provocando reacciones falsas positivas. El fragmento f(ab') o Fab se utiliza como reactivo para conjugados enzimáticos ya que se elimina.
Se ha incluido como índice de evaluación si el reactivo ELISA sándwich de doble anticuerpo se ve afectado por la RF.
El método sándwich de doble anticuerpo es adecuado para la determinación de antígenos bivalentes o macromoleculares superiores, pero debido a que no puede formar un sándwich de dos puntos, no es adecuado para la determinación de haptenos y antígenos monovalentes de molécula pequeña. .