Diseño de imprimaciones en línea Imprimaciones: ¿cómo diseñar imprimaciones con Primer6.0?
Diseño de cebadores QPCR + verificación en línea
Método 1: sonda NCBI
1 Antes de NCBI, existía una opción de sonda para diseñar cebadores directamente, que Upstream y. Se darán secuencias posteriores. Por ejemplo, busque el gen nanog de ratón y obtenga los dos cebadores siguientes:
Cebador ascendente: TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
Cebador descendente: ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
Método 2: Primer3web
Referencia: Diseño de imprimación en línea Primer3web: ¡aprenda el diseño de imprimación minimalista en 2 minutos! -Bili·Bili
2.1. Encontrar la secuencia del gen
Tomar p53 humano como ejemplo para diseñar cebadores.
Sitio web oficial de PubMed:
Paso 1: Seleccione el nucleótido en la opción desplegable.
Paso 2: Introduzca gen+especie+ARNm (por ejemplo, p53humanmRNA).
Paso 3: Haz clic en Buscar.
Paso 4: Haga clic y seleccione (mRNA4.782) en la columna de la izquierda.
Paso 5: Haz clic para entrar al primer artículo de p53humanmRNA que estamos buscando (Homosapiens_mRNA_for_p53, CDs completos).
Paso 6: Haz clic en la opción CDS en la función Seleccionar.
Paso 7: Haz clic para seleccionar el formato FASTA y aparecerá la serie CDS de este gen.
2.2. Empezar a diseñar cebadores.
Sitio web oficial de Primer3web:
/
Después de ingresar al sitio web oficial de Primer3web, realice las siguientes operaciones:
Paso 1: Seleccionar entre los elementos desplegables especie (humana).
Paso 2: Ingrese la secuencia CDS que acaba de copiar en el cuadro de entrada.
Paso 3: Haz clic para seleccionar los cebadores.
Paso 4: generar la secuencia del cebador; en el resultado final, hay cuatro pares de cebadores para elegir.
Elige la prebase adecuada: ¿Cómo conseguir la adecuada?
En primer lugar debemos fijarnos en la longitud de amplificación de los cebadores. Lo mejor es amplificar entre 100 y 300 pb.
La longitud de los cebadores es de 20 a 25; pb, y la diferencia entre los cebadores ascendentes y descendentes no debe exceder los 5 pb.
Luego observe el valor de Tm, que es de aproximadamente 60 ℃, y la diferencia no debe exceder 1 ℃.
Un punto más:
Dado que los cebadores de qPCR están diseñados, deben diseñarse en todos los exones para evitar el impacto del ADN genómico en los valores de CT. Si no se abarcan los exones, el valor CT de la curva de fusión amplificada será menor. Entonces, ¿cómo saber si los cebadores que diseña están diseñados en todos los exones?
La respuesta es que podemos comparar la posición genómica de los cebadores que diseñamos con las posiciones de unión de los exones e intrones del gen en NCBI. Basta mirar la posición de conexión del ARNm de ese gen.
Método 3: NCBI-explosión-primer-explosión
Una vez completado el diseño del cebador anterior, es demasiado problemático buscar manualmente si el cebador cruza el intrón. Luego popularice un método más conveniente.
Referencia:
3.1: Encontrar la secuencia de ARNm del gen diana en NCBI.
Abra la página principal del NCBI, seleccione el gen, ingrese el nombre del gen--"Mostrar muchos genes diferentes con el mismo nombre--"Encuentre la especie que desea, abra--"Mostrar información genética, busque delante de "mRNAandprotein" nm * * * * * * *, número de copia
Nota: En este momento verás mucha información sobre NM**** *, indicando que las diferentes isoformas de este gen se puede pasar. Consulte la literatura y la explicación detrás de estas secuencias de genes para determinar si no está claro, generalmente elija el más largo
3.2. p>
Abra el sitio web NCBI. -BLAST-primer-blast, ingrese el número de ARNm copiado arriba en el cuadro de secuencia, seleccione su especie en las opciones desplegables, luego seleccione la unión primerusspananexon-exón en el cuadro desplegable Exonjunctionspan. , establezca las longitudes mínima y máxima del cebador, luego haga clic en Obtener primer. Puede saltar a la página de resultados de Primer-blast. Este proceso llevará un tiempo. Cuando aparezca, habrá una columna llamada Vista gráfica de pares de primer. p>Seleccione el mejor par de estos pares de cebadores que abarcan el exón:
a) Solo un cebador de un par abarca un exón (porque un cebador abarca un intrón), por lo que este cebador. no coincidirá con el ADN genómico Incluso si el otro cebador coincide con el ADN genómico, un cebador no amplificará nada.
Debido a que la amplificación de un cebador no logra un crecimiento exponencial, después de docenas de ciclos, la señal queda enmascarada por la señal de crecimiento exponencial correctamente emparejada. Al igual que en la PCR normal, sólo hay cebadores ascendentes o descendentes, en la PCR no hay absolutamente ninguno. Porque la producción es demasiado baja. )
b) La distancia entre un par de cebadores no debe ser demasiado larga, porque el producto de amplificación debe estar entre 100 y 300 pb, lo que afectará el valor de ct.
¿Qué produce el producto PCR de verificar los cebadores que diseñas? Puedes hacer una PCR electrónica para ver.
1. Herramienta UCSC-Chip PCR
Ingrese a UCSC, seleccione la herramienta In-SilicoPCR, ingrese los cebadores ascendentes y descendentes, seleccione el ensamblaje del genoma en el objetivo, haga clic en Enviar o Si no puede pasar de esta manera, recuerde marcar FlipReversePrimer. Porque aguas arriba y aguas abajo pueden invertirse. Si el envío es exitoso, aparecerá una secuencia larga, que le indicará la posición y la longitud inicial y final de la secuencia generada después de completar la PCR electrónica. Luego use la opción genética de NCBI para ingresar el gen objetivo de su propia PCR. Al observar la posición inicial del gen objetivo, sabrá si la PCR es la secuencia del gen objetivo.
Nota: La secuencia generada por OCR solo puede ser parte del gen diana, basta con comparar la posición inicial de la secuencia. Debido a que los cebadores se diseñan utilizando el gen diana, la secuencia entre los dos cebadores se obtiene mediante PCR.
Ingrese NCBI-BLAST-primerBLAST; o vaya directamente a este sitio web: Primerdesigningtool()
Ingrese los cebadores ascendentes y descendentes que acaba de diseñar en el parámetro primer.
Seleccione RefseqmRNA en la opción desplegable de la base de datos.
Haz clic en Getprimer nuevamente
Espera un momento, quedará bloqueado por un tiempo antes de salir.
Se publicó un informe preliminar detallado que decía que los productos en la plantilla objetivo son transcripciones diferentes de HomosapientumorproteinP 53 (TP53) y que la longitud de los productos es la misma. Indica que el gen es amplificado por estos cebadores.
Las ventajas y desventajas de los dos métodos de verificación:
El método de verificación UCSC puede probar todas las secuencias que usted amplifica;
BLAST del NCBI solo puede proporcionar la amplificación si el producto es el gen que desea y la longitud del producto amplificado.
Selección: Se recomienda utilizar el método NCBI-blast-primer-BLAST para diseñar cebadores. También puede utilizar el método NCBI-BLAST-primer-BLAST para verificar los cebadores que diseña.
Consejos para compartir tecnología para diseñar cebadores qPCR - Zhihu()
Por ejemplo, los cebadores qPCR diseñados para el gen Syt4 (ratón).
Paso 1: Introduce el gen NCBI y encuentra el número NM * * * * del ARNm del gen.
Paso 2: Ingrese el número en el cuadro de secuencia de entrada NCBI-Explosión-Detonador-Explosión y verifique las condiciones correspondientes; la longitud del producto de PCR está limitada a 70-300; por lo tanto, diseñe 10 cebadores; que abarca el intrón y seleccione el segundo par de cebadores según las condiciones de Tm:
Ascendente: GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
Ascendente: CCAACCGTCCAATCACCTCA
Paso 3: Vuelva a ingresar esto par de cebadores en las cajas de cebadores aguas arriba y aguas abajo de NCBI-BLAST-primer-blast y haga clic en Getprimers. Se descubrió que el único gen amplificado por este par de cebadores era el gen Syt4, lo que indica que este par de cebadores tiene buena especificidad.
Paso 4: ingrese UCSC-Tools-In-Silico PCR, ingrese los cebadores ascendentes y descendentes y haga clic en Enviar. Si no aparece ningún producto después de que aparezca, regrese y ajuste los parámetros, como el parámetro de destino, FlipReversePrimer: si se debe verificar, etc. El producto final es Syt4 con una longitud de 220 pb. Esto muestra que el producto de PCR de este par de cebadores es altamente específico y tiene un solo producto.
Paso 5: Verificación adicional: debido a que el cebador fue diseñado para pasar a través del intrón, me recordaron que el cebador anterior pasó a través del intrón, así que ingresé NCBI-Nucleotide, ingresé: Syt4MusmusculusmRNA, haga clic en Buscar, luego haga clic en ARNm en la columna de la izquierda, luego haga clic en el primer elemento... Consulte el paso 2.1 anterior. Buscando la secuencia CDS de este gen. Después de encontrar la secuencia CDS, buscamos los cebadores aguas arriba y aguas abajo y descubrimos que ambos estaban en la región CDS. Las secuencias del producto de PCR de estos cebadores también estaban en la región CDS. Después de una inspección cuidadosa, descubrimos que el cebador aguas arriba estaba ubicado en 1203-1224 y, de hecho, abarcaba dos exones: el exón 1098..126544.
Arriba, diseñamos la secuencia del cebador qPCR del gen Syt4. Puede ser sintetizado directamente por la empresa.
Los anteriores son diseños de cebadores para qPCR. Generalmente, los productos genéticos amplificados tienen solo entre 100 y 300 pb y se utilizan para análisis cuantitativos o semicuantitativos.
Pero si desea amplificar el ADN de longitud completa, necesita el software Primer5. Usted mismo puede configurar la longitud del producto de amplificación.
Cómo utilizar el software PrimerPremier5 para diseñar cebadores de PCR - Baidu Experience ()
¿Cómo diseñar Primer3 online? En primer lugar, depende de para qué se utilice la imprimación que hayas diseñado. Si se utiliza para la detección por PCR normal o RealtimePCR, copie la secuencia de ARNm y seleccione el tamaño correspondiente. En principio, el tamaño del producto de la PCR ordinaria se controla entre 250~600bpRealtimePCR y 100~200bp. Es mejor destruir los pares de cebadores proporcionados por el sistema y elegir pares de cebadores que abarquen exones.
No es necesario que prestes demasiada atención a las reglas clásicas del diseño de primers, como el número de GC% al final. El algoritmo de diseño propio de Primer3 es muy bueno. Los cebadores diseñados a tiempo tienen una estructura de horquilla dímera, que no afectará el uso o incluso será muy fácil de usar.
Si se trata de una secuencia fija extendida, básicamente no hay necesidad de usar Primer3 para observar el% de GC. En promedio, no hay secuencias repetidas continuas. Esta parte es otro punto.
¿Cómo diseñar cebadores con Primer6.0? 1. Primero, seleccione la secuencia del gen objetivo. No hay ningún requisito para el formato, simplemente copie la secuencia del gen objetivo.
2. Abra "Nuevo" en el directorio de archivos y luego seleccione "Secuencia". Otra opción del proyecto aquí es la forma de importar archivos, es decir, guardar el gen objetivo como un archivo que se puede importar directamente al archivo. Por lo general, copiar es más fácil.
3. Después de abrir la secuencia, aparecerá un cuadro para pegar. Simplemente pegue la secuencia genética que acaba de copiar y haga clic en Agregar a continuación.
4. Selecciona el botón con las flechas rojas y azules arriba para diseñar cartillas. Antes de que comience el diseño, puede cambiar los parámetros de diseño, incluido el rango de bases buscado, la longitud del cebador, la cantidad de bases, la cantidad de cebadores que se muestran en los resultados del diseño, etc.
5. Después de configurar los parámetros, haga clic en Buscar a continuación y el software comenzará a analizar el diseño. Cuando termine, haga clic en Aceptar. Los resultados del diseño se mostrarán de la siguiente manera.
6. En los resultados, el azul es el cebador frontal, el rojo es el cebador posterior y la calificación es la puntuación de evaluación integral del cebador. Los pros y los contras de las cartillas también se mostrarán en la parte superior, siendo la mejor la mejor, la media buena y la peor mala. Generalmente el primer elegido es el mejor o mejor y no está disponible para otros monitores.
7. Hay dos opciones a la derecha. AllPrimers le permite ver varios pares de cebadores diferentes para elegir. Según sea necesario, se pueden seleccionar imprimadores con posiciones y longitudes de producto apropiadas. Una vez seleccionado, debe hacer clic en Reemplazar a continuación para reemplazarlo.
8.AllStructers puede ver la estructura del cebador seleccionado actualmente, como la estructura en horquilla, el dímero del cebador y las bases repetidas.
9. Después de seleccionar el cebador, haga clic en la secuencia del cebador a continuación, luego haga clic derecho para que aparezca la opción de copiar la información y luego exporte el cebador diseñado. También puede exportar los resultados directamente a un archivo.