¡Gran hombre en la historia de la ingeniería genética!
En cierta época en los Estados Unidos, las prostitutas podían trabajar como prostitutas en laboratorios, los hippies podían obtener títulos y las impurezas en la naturaleza eran acuosas. Cuantos más errores cometas, más cerca estarás del éxito. Por supuesto, se supone que la tasa de precisión es constante. Cuanto más errores hay, más intentos hay.
Dios sabe si este tipo ha encontrado su corazón...
El último zar Nicolás II, el virus de la gripe de 1918, la película "Parque Jurásico" y Simpson asesinando a su mujer. ¿Cuál es la conexión entre estas cuatro cosas? La respuesta es no. Es sólo un nuevo invento en biotecnología en la última década lo que los une. Esta técnica se llama "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR).
La característica más importante de la PCR es que puede aumentar considerablemente la cantidad de ADN. Por lo tanto, siempre que se pueda aislar un poquito de ADN, se puede amplificar y comparar mediante PCR, ya sea un fósil, los restos de un personaje histórico, o las manchas de cabello, piel o sangre que dejó el asesino en un Caso de asesinato hace décadas. Este es también el poder de las “pruebas de rastreo”.
Los principios y prácticas de PCR en realidad no son difíciles. Utiliza el principio de replicación bicatenaria del ADN para copiar continuamente una secuencia de ADN, lo que hace que su número crezca exponencialmente, lo que puede usarse para análisis cualitativos y diversas aplicaciones. La estructura de doble hélice del ADN fue descubierta en 1953, estableciéndola como la molécula portadora de la información genética en las células. La primera polimerasa (P de PCR) utilizada para copiar ADN en células también se aisló con éxito ya en 1956. Copiar ADN en tubos de ensayo ha sido una práctica rutinaria en muchos laboratorios durante décadas, pero nadie pensó en copiar ADN en grandes cantidades mediante PCR, e incluso si lo hicieran, no pensaron que fuera posible hasta 1983.
Cuando el ADN se replica, las dos hebras complementarias unidas por enlaces de hidrógeno primero deben separarse antes de que puedan usarse como plantilla para la replicación. La forma más sencilla de abrir una doble hélice es aplicar calor. A altas temperaturas, las cadenas de ADN bicatenario se separarán en cadenas simples. Cuando la temperatura baja, las dos cadenas de ADN complementarias pueden volver a convertirse en cadenas dobles. Aunque las moléculas de ADN pueden soportar altas temperaturas, la polimerasa necesaria para la replicación del ADN es una proteína y las proteínas pierden actividad a altas temperaturas. Ésta es una de las razones por las que investigadores anteriores creían que este método no era viable. Y de forma similar a encontrar una aguja en un pajar, "agarrar" el fragmento deseado entre miles de fragmentos de ADN de un cebador corto que consta de una secuencia conocida es otra razón por la que resulta desalentador.
El inventor de la PCR es generalmente reconocido como K. Mullis, por el que ganó el Premio Nobel de Química en 1993. En muchos escritos, incluido un artículo de 1990 en Scientific American y su autobiografía de 1998 Dancing Naked in the Psychic Realm, Morris ha mencionado los orígenes de la idea de la PCR. Sin embargo, ¿es la PCR realmente obra exclusiva de Mullis desde su concepción hasta su implementación? ¿En qué circunstancias nació la PCR?
Morris, bioquímico de nacimiento, se doctoró en la Universidad de California, Berkeley, en 1972, especializándose en síntesis orgánica. Temprano en la mañana mostró un carácter rebelde. En aquellos días hippies, tomar LSD casero no era demasiado inusual, y a Mullis le parecía bien. Aún más increíble es que se le ocurrió una teoría para explicar la cosmología del Big Bang durante un viaje con LSD, la escribió, la envió a Nature y, de hecho, la publicó. Así que aprobó el examen de doctorado porque no había muchos profesores publicando en Nature y aún menos estudiantes. En cuanto a su tesis doctoral, también fue escrita de forma coloquial, con un toque de humor (como decía el propio Mullis). Si el tolerante instructor no hubiera hablado por él, quizás habría tenido que reescribirlo.
La otra afición descarada de Mulis son las mujeres, lo que también ha supuesto muchos cambios en su carrera. Después de obtener su doctorado, vino a Kansas con su segunda esposa recién casada. Debido a la relación de su esposa, ingresó a la escuela de medicina del estado, donde también encontró un trabajo que no estaba relacionado con su título de cardiología. Pronto se disgustó porque el experimento requería matar muchas ratas. En 1975, se divorció de su esposa y regresó al Área de la Bahía con su tercera esposa, donde trabajó como gerente de una panadería propiedad de su primera esposa durante casi dos años. No fue hasta 1977 que regresé al Laboratorio de Química Medicinal de la UCSF. Todavía no estaba en el camino académico correcto y rápidamente me cansé de mi nuevo trabajo.
En 1979, Murrays se unió a una empresa privada de biotecnología llamada Sethus en el Área de la Bahía. Las empresas de biotecnología estaban en su infancia en ese momento y pocos académicos estaban dispuestos a dejar las sombras de la torre de marfil para trabajar en el sector privado. Incluso si voy a una gran empresa farmacéutica, no obtendré el reconocimiento ni las bendiciones de la mayoría de mis compañeros. Siento que este es el final de mi carrera académica. Sin embargo, Sitex es un lugar muy especial. Esta empresa ha reunido un grupo de científicos capaces y soñadores, y en un ambiente libre y abierto, * * * avanza hacia los objetivos marcados. Esto es muy diferente de la práctica de los profesores universitarios y anfitriones de laboratorio comunes que trabajan a puerta cerrada para perseguir sus propios objetivos. Sites contrató a Murris porque quería confiar en su experiencia en síntesis química orgánica para sintetizar oligonucleótidos experimentales (moléculas cortas de ADN).
Desde la década de 1970, debido al descubrimiento de las endonucleasas de restricción que cortan y unen selectivamente las moléculas de ADN, las moléculas de ADN pueden recombinarse, lo que condujo al desarrollo de la ingeniería genética y al surgimiento de la industria biotecnológica.
Como resultado, Sites pasó de ser una empresa que producía principalmente vitaminas y antibióticos en la década de 1970 a una empresa que se dedicaba principalmente a la investigación y el desarrollo de productos genéticos en la década de 1980... hormona del crecimiento, insulina, factores de coagulación, interferones, interleucinas, etc. , son todos objetivos de investigación y desarrollo de Sites. En 1981, Sites se convirtió oficialmente en una empresa que cotiza en bolsa y recaudó una gran cantidad de fondos.
Fue en esta atmósfera que Morris entró en escena. De hecho, lo que estaba haciendo no era investigación, sólo quería mejorar la eficiencia de la síntesis de oligonucleótidos. Murris pasó mucho tiempo jugando con las computadoras personales recientemente populares (aún no las de IBM), y a menudo se le ocurrían ideas extrañas, la mayoría de las cuales eran erróneas. Su carácter combativo y su renuencia a aceptar críticas también le granjearon enemigos en todas partes. Su relación con el sexo opuesto en el trabajo causó muchos problemas, e incluso el supervisor laboral tuvo que presentarse para solucionarlo. En 1981, fue ascendido a jefe del departamento de síntesis de oligonucleótidos. Para aumentar el rendimiento y ahorrar tiempo, omitió pasos de gestión de calidad, lo que provocó insatisfacción entre los usuarios que afirmaban que los oligonucleótidos de mala calidad causaban problemas en su investigación, y Mullis respondió que era insuficiente la capacidad del propio usuario.
La idea de la PCR nació en tales circunstancias. Según su propio relato, era un viernes por la noche de la primavera de 1983, cuando llevó a su novia a una cabaña en el campo para pasar el fin de semana. Conduciendo por una carretera rural sinuosa, le vinieron a la mente escenas de replicación repetida del ADN. Meurisse pensó que a alguien se le debería haber ocurrido una idea tan simple, pero después de buscar en la literatura, descubrió que no era así. Durante tres a cinco meses después de su "epifanía", Morris no tomó ninguna medida, por razones que aún no están claras. En agosto de ese año, Morris dio su primer informe formal sobre los principios de PCR en la empresa y la audiencia recibió una respuesta tibia. En primer lugar, todo el mundo está acostumbrado a sus ideas; es más, la mayoría de la gente piensa que este principio es demasiado simple. Si fuera posible, alguien ya lo habría hecho. De lo contrario, debe haber algo inviable en ello, pero nadie puede decir por qué no es factible.
Así que Morris tuvo que empezar a demostrar que la idea era factible. A partir de septiembre de 1983, Murris realizó algunos experimentos, cambiando varias plantillas de ADN y probando diferentes ciclos de calentamiento y enfriamiento. Los resultados no son lo suficientemente concluyentes. Como mucho, sólo forma una línea en el gel de electroforesis, sin convencer a otros de que la PCR desempeña un papel cada vez más importante. Desde junio de 1943 hasta junio de 1984, Morris causó problemas en la empresa debido a la relación entre hombres y mujeres, provocando la indignación del público y a punto de ser despedido. Como resultado, el jefe que lo presentó a la empresa intercedió por él y solo lo relevó de su puesto de supervisión, lo transfirió a otro grupo y le impidió establecer PCR dentro de un año.
La gente corriente suele subestimar la energía y el tiempo necesarios para cualquier método de investigación, desde el concepto hasta la aplicación práctica. Como el propio Mullis no tenía formación en biología molecular, la empresa envió a tres técnicos para ayudarle. Estas personas jugaron un papel importante en el desarrollo de la PCR. El 11 de junio de 1984, los técnicos de Muris obtuvieron por primera vez resultados creíbles, demostrando la viabilidad de la PCR. Entonces, a principios de 1985, la empresa tomó la decisión correcta al contratar a un técnico japonés calificado, Randall Saiji, para el trabajo. Antes de la llegada de los instrumentos automatizados, la PCR era un método experimental que requería mucha mano de obra y requería operaciones repetidas durante mucho tiempo y era difícil de realizar para personas con manos y pies débiles. El resultado del talento es limpio y hermoso, sin dejar lugar a dudas.
En la primavera de 1985, los ejecutivos de Sites estaban convencidos del potencial de la PCR y comenzaron a preocuparse por las filtraciones (el propio Muris era un bocazas) para que otros pudieran aprovecharse. En marzo, emitieron su primera solicitud de patente y también se están preparando para informar los resultados en la reunión anual de la Sociedad Estadounidense de Genética en junio y octubre, pero solo es seguro escribir un artículo formal antes de la entrega. Decidieron escribir dos artículos, uno sobre la teoría de la PCR, publicado primero por Murris, y el segundo sobre la aplicación de la PCR, centrándose en los resultados experimentales de Cai Mu y luego presentándolos. Como resultado, Morris pasó el verano jugando con la computadora, posponiendo una y otra vez la redacción de su tesis. Cuando se escribió y publicó otro ensayo de solicitud a finales de septiembre, Murris aún no se había mudado. Así que el primer artículo que menciona el método PCR se publicó en Science el 20 de febrero de 1985. * * * Hubo siete autores, ocupando el primer lugar, y Maurice ocupó el cuarto lugar.
No fue hasta junio 5438 + febrero de ese año que Morris completó el artículo y lo envió a "Nature". Pero Murris olvidó incluir una carta al editor y, por supuesto, no explicó en qué se diferenciaba el artículo del de Science, por lo que fue rechazado. Sorprendido, cambió a la revista Science y escribió una carta al editor con la ayuda de su supervisor Sitters, pero el manuscrito aun así fue rechazado. En ese momento, Morris dirigió su ira hacia la empresa, creyendo que se trataba de una conspiración de la empresa para robarle el crédito por inventar la PCR. Los debates sobre la prioridad de los inventos científicos y los méritos y deméritos son interminables en la historia de la ciencia. A menudo se dice que los suegros tienen algo de verdad. Sin examinar cuidadosamente los antecedentes y el proceso, es difícil saber la verdad basándose en unas pocas frases registradas por generaciones posteriores. En cuanto a que el concepto de PCR sea una creación de Murris, nadie tiene ninguna objeción, pero el proceso de realización del concepto es mucho más complicado.
Después de que el artículo de Morris fuera rechazado dos veces, alguien de la empresa sugirió votar por el método enzimático, principalmente porque alguien estaba familiarizado con el editor en jefe de la revista, Wu Rui, y tenía buena comunicación. Al mismo tiempo, la naturaleza de la PCR también es adecuada para publicaciones que enfatizan la metodología. Como resultado, el artículo de Murris finalmente se publicó, pero con un año de retraso y no salió a la luz hasta principios de 1987. En el artículo sólo se nombra a Morris y a otro técnico.
Para demostrar que no tenían intención de atribuirse el mérito, el Director de Sitios recomendó a Muris a Watson del Laboratorio Cold Spring Harbor (uno de los descubridores de la estructura de doble hélice del ADN) en la Facultad de Biología Molecular Humana. Simposio en mayo. Informe sobre los principios y resultados de las aplicaciones prácticas de PCR 1986. Esta fue la primera vez en su vida que invitaron a Mullis a dar una conferencia, y también estuvieron presentes figuras destacadas en el campo de la biología molecular. Como resultado, tuvo un buen desempeño y dio la impresión de que la PCR fue inventada por Murris. El número especial del "Simposio de Cold Spring Harbor" se publicó a finales de 1986. Antes del artículo "Métodos enzimológicos", Morris fue el primero.
Desde entonces, el nombre de PCR y sus poderosas aplicaciones se han vuelto ampliamente conocidos. Sin embargo, la clave para transformar la PCR en una tecnología verdaderamente madura fue la introducción de una ADN polimerasa termoestable.
Como se mencionó anteriormente, en el funcionamiento de la PCR, se requieren pasos repetidos de calentamiento y enfriamiento. La ADN polimerasa de E. coli utilizada en el ciclo anterior se desnaturalizará a alta temperatura, por lo que cada ciclo caliente y frío polimerasa fresca. debe agregarse al final. Este enfoque no sólo es engorroso sino también costoso. Según el precio de entonces, el valor de la polimerasa necesaria para un ciclo era de 1 dólar. Después de 30 ciclos, sería de 30 dólares. Después de más ciclos, el valor sería aún peor. Entonces, en la primavera de 1986, a Mullis se le ocurrió por primera vez la idea de utilizar enzimas termoestables. Después de buscar en la literatura, encontré dos documentos relevantes. El anterior fue elaborado en los Estados Unidos y el otro fue trabajo de científicos rusos y fue publicado en ruso.
El primer informe sobre el aislamiento de la ADN polimerasa termoestable fue el primer intento de un joven científico de la provincia de Taiwán. Del 65438 al 0973, Qian Jiayun fue al Departamento de Biología de la Universidad de Cincinnati en Ohio siguiendo la locura por estudiar en el extranjero. Su supervisor, J. Trela, sentía curiosidad por una bacteria termófila encontrada en las aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone, por lo que pidió a Qian y a otro estudiante estadounidense que hicieran de esta bacteria el tema de su tesis. Bajo la dirección de otro profesor, Qian aprendió a separar proteínas de las células y aisló con éxito la ADN polimerasa Taq resistente a altas temperaturas.
Después de obtener su maestría en 1975, Qian se trasladó a la Universidad Estatal de Iowa en Estados Unidos para obtener un doctorado en neurobiología. En 1982, volvió a enseñar en el Instituto de Neurociencia de la Facultad de Medicina de Yangming. Ha estado enseñando durante 20 años. Este trabajo histórico fue publicado en el Journal of Bacteriology en 1976. Ella fue la primera autora, pero usó el nombre inglés Alice y luego adoptó el apellido de su esposo (Chang), por lo que no mucha gente sabía que el autor de este artículo ampliamente citado era A. Chien.
Aunque Morris sugirió utilizar la ADN polimerasa Taq para la PCR, no estaba disponible en ese momento, por lo que tuvo que encontrar una manera de aislarla él mismo. Stuart tenía un equipo completo para separar proteínas y alguien dispuesto a asesorarlo, pero Morris era un procrastinador. Después de esperar varios meses, otras personas de la empresa tuvieron que hacerlo ellos mismos. Según los pasos publicados por Qian et al., la ADN polimerasa Taq purificada se aisló en tres semanas. En junio de 1986, Cai Mu la aplicó a la PCR. La primera vez, el efecto es sorprendente, se puede decir que es un éxito. La ADN polimerasa Taq no solo simplifica enormemente el trabajo de la PCR, sino que también tiene una especificidad y actividad más fuertes que las enzimas utilizadas anteriormente, y el ruido de fondo casi se elimina. . Desde entonces, la PCR ha sido un completo éxito.
Desde entonces, la relación de Morris y Situs se ha deteriorado. No cree haber cometido ningún error en el proceso de publicación del artículo y exige que todos los artículos publicados por PCR en los próximos cinco años lleven su nombre. También criticó en público a otros miembros de la empresa. Finalmente, Murris abandonó el sitio en septiembre de 1986. Sites le dio cinco meses de salario y una bonificación de 10.000 dólares estadounidenses, pero según la práctica de la industria, los derechos de patente de PCR pertenecen a Sites.
Después de dejar Sites, Murris continuó trabajando como consultor para algunas empresas de biotecnología, pero nunca publicó un artículo formal. Según él, la PCR la inventó él mismo. Después de ganar el Premio Nobel, no escuché mucho más. 19911 En febrero, Hoffmann-La Roche Pharmaceutical Co., Ltd. supuestamente compró la patente de la tecnología PCR de Sites por 300 millones de dólares y Sites pasó a la historia. Hasta hace poco, debido al trabajo publicado por Qian Jiayun y otros, la patente de la ADN polimerasa Taq ha sido cuestionada y la patente de la PCR también se ha visto afectada, pero esa es una historia para otro día.