Cómo hacer una curva estándar QPCR
Los detalles son los siguientes:
Método PCR-ELISA:
Utilizando digoxigenina o biotina como cebadores marcados, los productos amplificados se amplifican mediante la unión de una sonda sexual específica.
Luego se añade un conjugado anti-digoxigenina o anticuerpo biotinilado-peroxidasa de rábano picante y, finalmente, la enzima desarrolla el color del sustrato.
La PCR-ELISA convencional es solo un experimento cualitativo. Agregar un estándar interno y hacer una curva estándar también puede lograr el propósito de la detección cuantitativa.
Midiendo una determinada propiedad física y química de una serie de materiales estándar con componentes conocidos, se obtiene una curva compuesta por los valores numéricos de la propiedad.
Datos ampliados:
La tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real agrega grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, monitorea todo el proceso de PCR en tiempo real mediante la acumulación de señales fluorescentes y, finalmente, utiliza la curva estándar para analizar plantillas desconocidas para análisis cuantitativo.
Método de detección:
1. Método SYBRGreen:
Agregue el exceso de tinte fluorescente SYBR al sistema de reacción de PCR y el tinte fluorescente SYBR se mezcla específicamente en el Doblete de la cadena de ADN y luego emiten una señal fluorescente.
Las moléculas de colorante SYBR que no estén incorporadas a la cadena no emitirán ninguna señal fluorescente, asegurando así que el aumento de la señal de fluorescencia esté completamente sincronizado con el aumento del producto de la PCR.
Curva de fluorescencia de amplificación por PCR cuantitativa SYBR, curva de fusión del producto de PCR (el diagrama de pico único indica la singularidad de los productos de amplificación por PCR).
2. Método de sonda TaqMan:
Cuando la sonda está completa, la señal fluorescente emitida por el grupo informador es absorbida por el grupo extintor;
En PCR Durante el proceso de amplificación, la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima Taq degrada la sonda y separa el fluoróforo indicador del fluoróforo extintor, lo que permite que el sistema de monitoreo de fluorescencia reciba la señal de fluorescencia.
Es decir, cada hebra de ADN se amplifica para formar una molécula fluorescente, consiguiendo una completa sincronización entre la acumulación de señales fluorescentes y la formación de productos de PCR.
La señal de fluorescencia de los primeros 15 ciclos de la reacción de PCR se utiliza como señal de fondo de fluorescencia. El umbral de fluorescencia predeterminado se establece en 10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia en los ciclos 3-15. es decir, el umbral = 10 * sdcycle3-15.
Se puede producir una curva estándar utilizando un estándar con un número de copia inicial conocido, en la que la abscisa representa el logaritmo del número de copia inicial y la ordenada representa el valor Ct. Por lo tanto, siempre que se obtenga el valor Ct de la muestra desconocida, el número de copias inicial de la muestra se puede calcular a partir de la curva estándar.
Materiales de referencia:
Enciclopedia Baidu-Cuantificación de fluorescencia en tiempo real
Enciclopedia Baidu-Curva estándar