¿Cómo diseñar un detector experimental EMSA?
1) ¿Qué es el ensayo de desplazamiento de gel o de movilidad electroforética?
El ensayo de desplazamiento de gel o desplazamiento electroforético (EMSA) es una técnica para estudiar la interacción entre las proteínas de unión al ADN y sus secuencias de unión al ADN asociadas, y puede utilizarse para análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Esta técnica se utilizó originalmente para estudiar proteínas de unión a ADN y ahora se utiliza para estudiar la interacción de proteínas de unión a ARN con secuencias de ARN específicas.
Por lo general, las proteínas purificadas, los extractos celulares crudos y las sondas de ADN o ARN marcadas con isótopos 32P se incuban juntas, y los complejos y las sondas no unidas se separan mediante electroforesis en gel de polipropileno no desnaturalizante. Los complejos de ADN o de ARN se mueven más lentamente que las sondas libres. Dependiendo de la proteína de unión que se estudie, las sondas marcadas con isótopos pueden ser bicatenarias o monocatenarias. Para detectar proteínas de unión al ADN, como reguladores transcripcionales, se pueden utilizar proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas o extractos nucleares. Cuando se detectan proteínas de unión a ARN, se pueden utilizar proteínas purificadas o parcialmente purificadas o extractos de células nucleares o citoplasmáticas, dependiendo de la ubicación de la proteína de unión a ARN objetivo. En experimentos de competición, se utilizan fragmentos de ADN o ARN y fragmentos de oligonucleótidos que contienen secuencias de unión a proteínas (específicas) y otros fragmentos no relacionados (no específicos) para determinar la especificidad de las proteínas de unión a ADN o ARN. En presencia de fragmentos competitivos específicos y no específicos, la unión específica se determina en función de las características y la intensidad del complejo.
2) ¿Qué reactivos se necesitan para tal experimento?
Las proteínas de unión necesarias para los experimentos de cambio de gel pueden derivarse de proteínas purificadas o parcialmente purificadas o de extractos nucleares y citoplasmáticos crudos. También se debe preparar ADN o ARN marcado isotópicamente. Normalmente, las sondas de nucleótidos de ADN se marcan con polinucleótido quinasa g-32P y T4, y el ARN marcado con isótopos se sintetiza in vitro utilizando ARN polimerasa de bacteriófago y nucleótidos marcados con isótopos. ¿La ribosonda de Promega? El sistema /sup (a, b) (Cat. No. P1420, P1430, P1440, P1450, P1460) se puede utilizar para sintetizar ARN marcado con isótopos in vitro, así como el sistema de etiquetado del extremo 5' de ADN (Cat. No. u20). Los componentes necesarios para la reacción de unión son: Solución salina (cloruro de magnesio, cloruro de sodio o cloruro de potasio), sistema tampón (Tris-HCl o HEPESDI:dC), también puede contener detergentes no iónicos. ¿Se separa el complejo mediante electroforesis en gel de polipropileno no desnaturalizante después de unir la proteína a una sonda marcada isotópicamente, seguido de secado en gel para autorradiografía, o se utiliza el gel con imágenes de fosforescencia? /sup análisis.
3) ¿Qué reactivos se proporcionan en el sistema experimental de cambio de gel?
Promega proporciona un sistema experimental de cambio de gel para detectar proteínas de unión al ADN, que puede usarse como control positivo para tales experimentos. El sistema incluye oligonucleótidos diana, proteínas de unión al ADN de control, tampón de unión y reactivos necesarios para el etiquetado final de sondas de oligonucleótidos. El sistema central (número de catálogo E3050) consta de un extracto de E. coli que contiene proteína AP2 recombinante (extracto de AP2) y oligonucleótidos homólogos de AP2. El extracto de AP2 se extrae de E. coli que expresa la proteína AP2. Además, el sistema central contiene oligonucleótidos homólogos de SP1, tampón de unión por desplazamiento de gel (5') y extracto nuclear de HeLa para 20 experimentos de control. El sistema completo (número de catálogo E3300) contiene cinco oligonucleótidos bicatenarios adicionales que son homólogos a los sitios de unión para AP1, OCT1, CREB, NF-kB y TFIID. Estos oligonucleótidos se pueden utilizar como sondas específicas después del marcaje final o como sondas no específicas en experimentos de competición. Para obtener más información, consulte el Manual técnico del ensayo de cambio de gel TB110.
4) ¿Qué factores deben optimizarse para que un experimento de migración de gel sea exitoso?
El experimento de cambio de gel es teóricamente simple y rápido, pero para realizarlo con éxito, es necesario optimizar algunos parámetros, que se ven afectados principalmente por la fuente de la proteína de unión y las características de la sonda. sitio de unión.
Es necesario optimizar los siguientes factores: preparación de la solución de extracción (la contaminación por nucleasas y fosfatasas degradará la sonda), concentración de proteína de unión, concentración de la sonda, concentración de la sonda no específica, fórmula del tampón y pH, características de electroforesis en gel de polipropileno y condiciones de electroforesis. tiempo y temperatura de incubación, proteína portadora y si existen factores auxiliares (como zinc, cadmio y otros iones metálicos u hormonas). Brevemente, el volumen total de reacción debe ser mínimo (20 ul). Para cumplir con los requisitos generales, el tampón de unión contiene 4 mmgCl2, 1 mmgCl2, 0,5 mm EDTA, 0,5 mm DTT, 50 mm NaCl, 10 mm tris-HCl (pH 7,5) y 0,05 mg/ml poli(di:DC). ¿dI: dC o 10 mm de Hepes (pH 7,9), 50 mm de KCl, 1 mm de DTT, 1 mm de EDTA, 10 glicerol, 0,05 mg/ml de poli(DI: dC)? DI:dC se puede utilizar como punto de partida para experimentos de optimización. Para obtener más información, consulte el Manual técnico del ensayo de cambio de gel TB110.
5) ¿Qué cebadores polinucleotídicos homólogos se proporcionan y cuál es la fuente de secuencia de estos cebadores?
Existen muchos tipos de sondas de ADNbc, incluidos sitios de unión homólogos para diversos factores reguladores de la transcripción. La siguiente tabla enumera las sondas disponibles y las fuentes de estas secuencias de cebadores.
Sonda Reguladora de Transcripción
-
Nombre de la sonda Número de catálogo Secuencia (envoltura) Fuente de la secuencia
Sp1e3231, e 32325 ′-att CGA TCGGGGGGGGGGGCG-3′SV40 promotor (1)
AP 1e 3201e 32025′-cgcttgatgatcagccggaa-3′ Gen colagenasa TRE(2)
ap2e 3211e 32125 '- gatcga act GAC CGCC CCG CCG GT-3' metalotioneína II humana a(3)
gen NF-KB E3291, E3292, 5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′ gen de cadena ligera Igk de ratón (4)
oct 1e 3241e 32425′-TGT CGA ATG CAA ATC act aga A-3′ig gen de cadena pesada (5)
CREB e 3281e 32825′ -agagat TGC CTG ACG TCA GAC AGC Gen supresor de la hormona de crecimiento de rata Tag-3′ (6)
tfi id e 3221e 3222 5′-GCA gag cat ATA agg TGA gg taga-3′Belta-1 promotor de globulina.
Solo se enumera la secuencia de la cadena superior, la sonda es de doble cadena y la secuencia de la cadena inferior está emparejada con la secuencia de la cadena superior. La fuente en negrita indica que la secuencia se deriva de una secuencia genética específica y las secuencias unidas por reguladores transcripcionales se indican en las líneas siguientes. En general, los nucleótidos circundantes son arbitrarios.
¿Qué factores importantes hay que tener en cuenta a la hora de seleccionar sondas de ADN?
La longitud del ADN diana debe ser inferior a 300 pb para facilitar la separación electroforética de la sonda no unida y los complejos proteína-ADN. Se pueden utilizar oligonucleótidos sintéticos de doble cadena y fragmentos de enzimas de restricción como sondas en experimentos de cambio de gel. Si se ha identificado la proteína diana, se utilizan fragmentos de oligonucleótidos cortos (aproximadamente 25 pb) para que el sitio de unión pueda distinguirse del de otros factores. Se pueden usar fragmentos de restricción largos para localizar sitios de unión a proteínas en supuestas regiones promotoras/potenciadoras. Posteriormente, las transferencias de ADNasaI se pueden utilizar para analizar regiones específicas de unión a proteínas a nivel de secuencia de ADN.
7) Qué complejos se pueden formar con los siguientes reguladores transcripcionales y extractos nucleares de HeLa: ap1, AP2, CREB, nfkb, oct 1, sp1, tfiid, tfiib.
Cuando se utiliza el extracto nuclear de HeLa como fuente de proteínas de unión, cada factor regulador transcripcional se une a su secuencia homóloga de ADN asociada para formar una forma de unión característica. Cada regulador transcripcional se describe a continuación, incluida la supuesta secuencia homóloga, el tamaño del factor, las condiciones de unión específicas y la cantidad de complejos que se pueden formar con extractos nucleares de HeLa.
1.ap1: ap1 (proteína activadora 1) es un regulador de la transcripción, y su secuencia homóloga de unión es 5'-TGA gtca-3'. Cuando los sitios de unión de AP1 están presentes en la región promotora de los genes, estos genes pueden inducirse, por ejemplo, la proteína quinasa C (2,7) puede inducirse mediante ésteres de forbol. En las células, AP1 forma homodímeros de c-Jun o proteínas relacionadas con Jun, o heterodímeros de c-Jun o proteínas relacionadas con Jun y c-Fos o antígeno relacionado con Fos (Fras). La proteína fos por sí sola no puede formar homodímeros y no puede unirse sola al sitio de unión AP1. La proteína C-Jun es una proteína monomérica de 40 kDa que forma un homodímero a través de una cremallera de leucina. En las células HeLa, la forma principal de AP1 es un homodímero de la proteína c-Jun. En los experimentos de cambio de gel, se formaron complejos específicos. Para determinar la actividad de AP1 como ensayo de cambio de gel, además de los componentes de la solución base, ¿0,01 mg/ml de poli(dI:dC)? Di: DC), agregue 100 ug de BSA y 5 mm de DTT al tampón de unión. Si usa proteína purificada, use 1-2ug de proteína para detectar complejos migratorios.
2.AP2: AP2 es un regulador transcripcional que funciona como factor inductor de TPA y AMPc, respectivamente (10). Es una proteína de 52 kDa con la secuencia homóloga reconocida 5′-CCCGGC-3′ o 5′-GCCCNNGC-3′ (3). Este factor es particularmente sensible al ácido retinoico y puede desempeñar un papel importante en la morfogénesis. El extracto nuclear de HeLa formó un complejo específico con la sonda de ADN homóloga de AP2. Cuando se utiliza proteína purificada en experimentos de cambio de gel, utilice 20-50 ng de proteína.
3.CREB: CREB es un regulador transcripcional de 37 kDa que reconoce la secuencia homóloga de 5′-t(g/t) ACG TCA-3′DNA (6, 11) en respuesta al AMPc. Contiene una estructura de cremallera de leucina para formar un homodímero y el dominio básico relacionado es homólogo al dominio de unión c-JunDNA. Cuando se utiliza extracto nuclear de HeLa, puede formar complejos con secuencias homólogas de CREB.
4.NF-KB: Originalmente se identificó que NF-KB se une al potenciador de la cadena ligera de inmunoglobulina K en las células B. Pero más tarde se descubrió que en el citoplasma de las células no B se había formado un complejo de NF-kB e IkB. NF-kB se aísla inicialmente del complejo proteico de unión al ADN como un heterodímero compuesto de p65 (RelA) y p50. Otros monómeros aislados incluyen p49 (también conocido como p52), p75 (c-rel) y p68 (relb). Los p65, p68 y p75 monoméricos actúan como transactivadores. Los monómeros P50 y p49 (p52) tienen actividad de unión al ADN, pero solo una transactivación menor. Se ha informado que p49 y el monómero p65 de NF-κB forman un heterodúplex transcripcionalmente activo, similar al heterodúplex p50/p65. Los heterodímeros P49/p65 y p50/p65 están regulados en el citoplasma por un inhibidor llamado IkBa/MAD-3. La unión de IkB a los monómeros de p65 previene la localización en el núcleo y la unión al ADN. In vitro, altas concentraciones de p65 pueden formar homodímeros, que pueden unirse débilmente al ADN. El poli(dI:dC) puede inhibir esta reacción (14). P49 y p50 también pueden formar homodímeros, pero sus concentraciones en las células son muy bajas.
Normalmente, en los experimentos de cambio de gel de NF-kB, hay 0,28 picomoles de oligonucleótido NF-kB9 (pH 7,9), MKCl 50 mm, EDTA 0,2 mm, DTT 2,5 mm en un volumen de reacción de 20 ul, 65.438 00 glicerol y 0,05 NP. -. Cuando se utiliza proteína purificada, 250-300 ng son suficientes para formar complejos de desplazamiento de gel, mientras que se requieren 10 ug de extracto nuclear de HeLa. Los complejos desplazados en gel se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y los complejos desplazados en gel se separaron en electroforesis en gel de 7-poliacrilamida con Tris 50 mM (pH 8,3) y glicina 38 mM. Las soluciones de muestra que contienen colorantes azul de Coomassie y azul de xileno solo se pueden agregar a reacciones de control negativo porque estos dos colorantes exacerbarán la disociación del complejo NF-kB. Cuando se utiliza el extracto nuclear de HeLa como fuente de proteína de unión, se pueden formar dos complejos de desplazamiento de gel específicos de secuencia, a saber, el homodímero p50/p50 y el heterodímero p50/p65. Se pueden detectar cuatro complejos desplazados en gel específicos de secuencia (p49/P49, p50/P50, P50/p65, p49/p65) en células que expresan p49, p50 y p65. Si hay una concentración alta de p65, se pueden detectar pequeñas cantidades de p65/p65. Los siguientes reactivos pueden mejorar la unión de NF-kB in vitro: GTP mM, ATP, espermina, espermidina, iones de bario o calcio, ng Co 3(NH3)6 (12).
5.OCT 1: OCT 1 es un miembro de la familia de reguladores transcripcionales OCT y aparentemente está ampliamente presente en células de mamíferos (5). El dominio POU incluye la caja POU y el dominio de homología. Cuando se utilizan extractos nucleares de HeLa, se pueden detectar complejos desplazados en gel de secuencia homóloga formados con la sonda de homología OCT1.
6.Sp1: Sp1 es un regulador transcripcional O-glicosilado que reconoce la secuencia homóloga 5′-GGGGGGGGGC-3′(1) de 10 nucleótidos de longitud. La secuencia de reconocimiento central es 5′-GGGGGGGGGG-3 ′. En los promotores a menudo se encuentran secuencias similares a la secuencia central. Un ejemplo es el promotor temprano de SV40, que es el primer promotor capaz de unirse a SP1. Su peso molecular es de 95 a 105 kDa, dependiendo de la glicosilación, y las tres huellas digitales de zinc del dominio de unión al ADN determinan la especificidad de la secuencia. El extracto nuclear de HeLa forma complejos de desplazamiento de gel específicos con la sonda de homología SP1.
7.tfiid/TFIIB: tfiid y TFIIB son reguladores de la transcripción basal y participan en la transcripción basal del promotor de la ARN polimerasa II (16). TFIID forma una unión de ADN específica a la región TATA de promotores eucarióticos. TFIID está compuesto por varias proteínas, entre las cuales la proteína de unión al dominio TATA (TBP) participa en la unión de secuencias TATA. Los otros componentes proteicos de TFIID se denominan factores asociados a TBP (TAF). Se obtuvo una banda de desplazamiento de gel débil utilizando oligonucleótidos de sonda TFID y extractos nucleares de HeLa, pero fue difícil identificar el complejo de desplazamiento de gel específico de la secuencia TFID. Es difícil realizar experimentos de cambio de gel con TBP recombinante purificada, en parte porque el TBP tiene una fuerte carga positiva, lo que dificulta que el complejo TBP/ADN entre en el gel. La TBP purificada no puede unirse al ADN (17) después de formar dímeros. Por tanto, los dímeros formados pueden participar en la unión al ADN. TFIIB no se une solo al ADN, pero al unirse a TFIID, mejora la unión al ADN.
Después de que TFIIB se une al complejo de preiniciación, la ARN polimerasa II y TFIIF se unen a la región de inicio de la transcripción. Por tanto, TFIIB juega un papel importante en la formación del complejo de preiniciación. Cuando se utiliza TFIID purificado en experimentos de cambio de gel, no es necesario agregar poli(dI-dC) a la reacción de unión. El tampón de unión contiene 10 mm de glicerol, 20 mm de tris (pH 8,0), 10 mm de MgCl2, 2 mm de DTT y 89 mm de KCl. Se puede agregar poli(dG:dC) a los experimentos de unión en gel de TFIID.
dG: dC. El complejo formado se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La composición del gel fue: 0,5' TBE, gel de poliacrilamida 6 (acrilamida 19:1: dicotomía), 4 mmg de Cl 2, 0,02 NP-40, composición de tampón de electroforesis: 0,5'TBE, 4 mmMMgCl2. Al estudiar complejos que contienen TFIID y TFIIB, se debe eliminar el MgCl2 de los tampones de unión, geles y tampones de ejecución. Estos son requisitos generales. Al realizar experimentos de cambio de gel utilizando diferentes extractos celulares, formación de complejos TFIID y TFIIB, es necesario optimizar muchos factores para lograr las condiciones ideales.
8) ¿Cuánta proteína o extracto y sonda de ADN marcada se utilizan en los experimentos de cambio de gel?
Para cada sonda y proteína de unión específica, es necesario optimizar la proteína purificada, la proteína parcialmente purificada y el extracto nuclear crudo utilizados. Generalmente, la cantidad de proteína purificada está entre 20 y 2000 ng, y la proporción equimolar de proteína a ADN se puede ajustar a 5 veces la del ADN. Para los extractos nucleares crudos, se requieren de 1 a 20 µg de proteína para formar complejos específicos. La cantidad de sonda añadida en la reacción es 50.000-200.000 CPm32 sonda marcada con P (alta actividad específica) y el volumen de reacción es 65.438 0-5 ul. Esto corresponde a 10-50 mmol de sonda de ADN. Las sondas deben almacenarse a -20 °C para evitar la degradación y deben usarse dentro de 1 a 2 semanas después de la síntesis o el etiquetado. Tanto las sondas como las proteínas de unión deben evitar la congelación y descongelación repetidas.
9) ¿Se pueden preparar proteínas mediante traducción in vitro?
Promega no realiza este tipo de pruebas en todos los reguladores transcripcionales. Normalmente, el extracto de germen de trigo se utiliza para la traducción in vitro de factores de transcripción de mamíferos o proteínas de unión al ADN, y el lisado de reticulocitos de conejo puede contener factores de transcripción endógenos de mamíferos o proteínas de unión al ADN. ¿Pero qué pasa con el TNT? /sup gt; utilice el sistema de lisis de reticulocitos de conejo (a, b, c, d) para traducir el regulador de transcripción AP1 (c-Jun) con ARNt marcado con biotina Beyond TM (n.º de catálogo E3201) para producir un oligonucleótido homólogo de AP1 ( número de catálogo E3201). ¿TNT? /sup gt; traducción in vitro de c-Rel mediante extractos de germen de trigo conjugados con T7 (b, c, d, e). Esta proteína migra específicamente como una sonda del potenciador de la cadena ligera de inmunoglobulina K. Agregar MAD-3 (un miembro de la familia IKB) que se traduce en una reacción de unión a c-Rel in vitro puede interferir con su interacción.
10) Poli(dI:dC)? DI: dC), ¿cuáles son las funciones del ADN competitivo no específico y del ADN competitivo específico?
Está compuesto por inosina y citosina. Debido a su estructura especial, puede inhibir la unión no específica de proteínas a sondas marcadas y evitar falsos complejos. ¿Agregar poli (dI: dC) a la reacción de cambio de gel? DI: dC) puede inhibir la unión de otras proteínas de unión al ADN en extractos nucleares crudos, como la unión no específica de reguladores de la transcripción. Al purificar proteínas para su uso en reacciones de cambio de gel, ¿no es necesario agregar poli(dI:dC)? DI: dC), si se agrega, la concentración final utilizada en reacciones ordinarias no excederá los 50-100 ng. Para extractos nucleares, ¿utilizar 1 ug de poli(dI:dC) por 2-3 ug de extracto nuclear? dI:dC) Para determinar la especificidad del complejo formado, se realizaron experimentos competitivos de la reacción de unión con o sin cantidades crecientes de ADN competidor específico no radiactivo o ADN competidor no específico. En términos generales, el ADN específico no radiactivo es una sonda de ADN no marcada, ADN competitivo no específico, y tiene la misma composición de longitud que la sonda de ADN, pero una secuencia diferente. Los complejos que compiten con el ADN específico no radiactivo pero que no pueden competir con el ADN competidor no específico indican una unión específica de la proteína diana y la sonda marcada con isótopos. La unión no específica puede competir con ADN específico y ADN competidor no específico. ¿Poli (dI: dC) en solución vinculante? DI: dC) debe optimizarse, pero generalmente se utilizan 0,05 mg/ml.
La dosis de ADN competitivo no radiactivo (específico o no específico) también debe optimizarse o titularse, pero el ADN competitivo suele ser entre 10 y 1000 veces (p/p) la de la sonda marcada isotópicamente. Otros tipos de ADN competidor, como el ADN del timo de ternera, no se pueden utilizar en reacciones de cambio de gel y llevarán sitios de unión para la proteína objetivo.
11) ¿Qué condiciones de gel se utilizan para separar complejos proteína/sonda y sondas libres?
La proteína unida o el extracto nuclear crudo se combina con la sonda objetivo, y el complejo proteína/sonda y la sonda libre se pueden separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La concentración de poliacrilamida es generalmente 6 (30:1 acrilamida: binaria), y se pueden usar concentraciones altas o bajas bajo ciertas condiciones. El pH, la concentración de poliacrilamida y la proporción de acrilamida a acrilamida dibloque afectarán la migración del complejo en el gel. Se utiliza un voltaje de 10 a 15 voltios para la mayoría de las proteínas, y una breve ráfaga de alto voltaje (30 a 35 voltios) para las proteínas que se disocian rápidamente. El TBE y el TAE utilizados en la electroforesis deben prepararse nuevamente sin precipitación. La baja fuerza iónica y el "efecto caja" de la matriz de acrilamida contribuyen a la estabilidad del complejo. El tampón TGE (Tris 12,5 mM, pH 8,3, glicina 95 mM, MEDTA 0,5 mM) también se puede utilizar para complejos inestables de proteína/ADN. Los experimentos de unión y electroforesis se pueden realizar a 40 °C para evitar la disociación de complejos y sondas inestables. Los pigmentos en la solución de muestra pueden causar la disociación de complejos inestables, por lo que se deben usar soluciones de muestra que no contengan azul de Coomassie ni azul de xileno. Cuando el patrón de bandas no es apretado y aparecen colas, indica que el compuesto está disociado. El gel debe estar completamente polimerizado para evitar la formación de bandas. Si el complejo no ingresa al gel, se usa exceso de proteína o sonda, o la concentración de sal es demasiado alta para la reacción. No hay sondas libres ni complejos en las tiras de papel que contienen el extracto, pero sí en las tiras de papel que contienen solo las sondas, lo que indica que los extractos están contaminados por ácidos nucleicos o fosfatasas, por lo que es necesario realizar la neutralización. y reacciones de unión en los extractos. Añadir el inhibidor correspondiente. Actualmente es posible separar complejos proteína/sonda utilizando geles de agarosa de alta resistencia (metáfora?/sup/agarosa).
12) ¿Cómo determinar la presencia de una proteína en un compuesto específico?
Proteínas parcialmente purificadas o extractos nucleares crudos y sondas específicas pueden formar uno o varios complejos proteicos específicos. La presencia de múltiples complejos indica degradación de proteínas y se deben agregar inhibidores de proteasa a la solución utilizada para preparar el extracto y durante la reacción de unión. Puede resultar difícil determinar la identidad de las proteínas del complejo, pero hay formas de estudiarla. Si hay un anticuerpo contra la proteína objetivo, se puede realizar un experimento de supershift. El anticuerpo se une a la proteína en el complejo proteína/sonda y retrasa la migración del complejo, formando un supershift. Añadir anticuerpo incremental a la reacción de unión. Se pueden agregar anticuerpos a la proteína después de la reacción con la sonda, o se puede conjugar el extracto con el anticuerpo antes de agregar la sonda. Dependiendo del epítopo específico del anticuerpo, el primero facilita la formación de complejos supershift, mientras que el segundo previene la formación del complejo, lo que resulta en una reducción de la fuerza del complejo original. La mayoría de los experimentos implican titular el anticuerpo a una proporción molar de anticuerpo a proteína de 1:1 y luego aumentar la cantidad de anticuerpo. Cuando hay proteínas purificadas presentes, se pueden comparar con complejos experimentales de cambio de banda. Además de los experimentos de supercambio, las proteínas del complejo también se pueden caracterizar mediante reticulación UV y transferencia de etiquetas. Después de la incubación de sondas y extractos nucleares uniformemente marcados, los complejos se entrecruzan mediante irradiación UV y luego la sonda desprotegida se degrada mediante DNasa. Se requieren sondas marcadas uniformemente porque las desoxirribonucleasas eliminarán las etiquetas de las sondas marcadas en los extremos. Las proteínas entrecruzadas por varios nucleótidos protegidos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, se secaron y se autorradiografiaron. El peso molecular de la proteína unida se puede comparar con una referencia molecular estándar. El análisis de transferencia Western también se puede realizar en complejos con anticuerpos contra la proteína diana (20). Si una proteína se une a una secuencia específica de una sonda de ADN, se puede caracterizar por oligonucleótidos competitivos que contienen secuencias de unión conservadas y mutantes. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede utilizar para alterar los sitios de unión en secuencias conservadas para estudiar la formación de complejos.
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