Recomprensión de los experimentos básicos (5): correlación de PCR
En ese momento, el impacto en PCR fue medio, pero no hubo problemas operativos. Pero pensándolo bien, como en otros experimentos, mis conocimientos eran mínimos, y lo mismo ocurre con la PCR. Por eso creo que es necesario volver a aprender varias tecnologías y principios relacionados con la PCR.
Vaya al grano
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) La reacción en cadena de la polimerasa, también conocida como tecnología de amplificación de ADN in vitro, fue iniciada en 1985 por Kary Mullis de la American Sethus Company. , que puede amplificar una pequeña cantidad de fragmentos de ADN más de un millón de veces. El propio Kary Mullis ganó el Premio Nobel de Química en 1993.
He compartido canciones de PCR antes, repasémoslas aquí primero y luego organicemos sistemáticamente el conocimiento relevante de PCR.
1. Principio de la PCR
Bajo la catálisis de la ADN polimerasa, se utiliza el ADN madre como plantilla y cebadores específicos como punto de partida para la extensión. El proceso de replicar el ADN hijo complementario del ADN molde madre in vitro mediante pasos como la desnaturalización, la hibridación y la extensión.
La reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para amplificar fragmentos cortos de ADN conocidos, que pueden ser un solo gen o solo una porción de un gen. A diferencia de los organismos vivos, la PCR sólo puede copiar fragmentos de ADN muy cortos, normalmente de no más de 10 kpb. El ADN es una molécula de doble cadena, por lo que su tamaño se mide en términos de las unidades estructurales (nucleótidos) de las dobles cadenas del ADN complementario, en pares de bases (pb).
2. Componentes de la reacción PCR
Plantillas
Demasiadas:
Aumenta las bandas no específicas.
Demasiado poco:
El rendimiento de la PCR disminuye.
Cebadores
Las secuencias conocidas en ambos extremos del fragmento de ácido nucleico preamplificado determinan la especificidad.
Alto:
La amplificación y el desajuste de productos no específicos aumenta la formación de cebadores-dímeros entre cebadores y reduce el rendimiento.
Bajo:
Rendimiento reducido.
Polimerasa
Alta termoestabilidad
Alta:
Amplificación de productos no específicos de primers.
Bajo:
Se reduce el número de productos.
dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Demasiado alto:
Acelerar la velocidad de reacción también aumentará la mala incorporación de tarifas de bases y el costo de las pruebas de laboratorio.
Demasiado bajo:
Reducir la velocidad de reacción puede mejorar la precisión del experimento.
Tampón
Ion magnesio
La enzima Taq depende de Mg2+, lo que afecta significativamente la especificidad de la reacción y el rendimiento de fragmentos amplificados.
Exceso:
Aumentará la amplificación no específica y afectará al rendimiento.
Demasiado bajo:
La actividad enzimática se reduce significativamente.
Tris-Cl de 10~50 mm (pH 8,4)
Mantiene el ambiente alcalino de la enzima Taq.
KCl 25~50 mM
Promueve el recocido del cebador, >> 50 mM inhibirá la actividad de la enzima Taq.
100 μg/ml de albúmina sérica bovina (BSA)
Tiene cierto efecto protector sobre las enzimas. Si la calidad no es buena tendrá un efecto contraproducente. Se recomienda BSA acetilada. La gelatina, el Tween-20 y el ditiotreitol (DTT) tienen efectos similares.
3. Pasos básicos de la reacción de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa general consta de 20 a 35 ciclos, y cada ciclo incluye los siguientes tres pasos:
Desnaturalización:
Recocido o ligadura:
Extensión (Extensión):
4. Optimización de las condiciones de reacción de PCR
1. :
Asegurarse de que el ADN molde se derrita es la clave para garantizar el éxito de toda la amplificación por PCR.
Cuando se calienta a 90~95 ℃ durante 30~60 segundos, incluso las moléculas de ADN más complejas se convertirán en hebras simples.
Una temperatura excesivamente alta o una temperatura alta que dure demasiado tiempo destruirán la actividad de la enzima Taq y las moléculas de dNTP.
2. Temperatura y tiempo de replegamiento:
La especificidad de la amplificación por PCR depende de la combinación de cebadores y plantillas durante el proceso de renaturalización.
Cuanto mayor sea la temperatura de renaturalización, mayor será la especificidad del producto. Cuanto menor sea la temperatura de renaturalización, menor será la especificidad del producto.
Se debe configurar según el valor de Tm del cebador.
3. Temperatura y tiempo de extensión:
Generalmente, la temperatura óptima de la enzima Taq es entre 70 ~ 75 °C. Cuando el cebador tiene menos de 16 nucleótidos, la extensión será. demasiado alta. La temperatura no favorece la unión de cebadores y plantillas, por lo que la temperatura se puede aumentar lentamente a 70 ~ 75 °C.
El tiempo de reacción de extensión puede depender de la longitud del fragmento a amplificar, menos de 1 KB y 1 min es suficiente. Si es mayor a 1kb, se ampliará el tiempo de extensión.
La enzima Taq se puede utilizar en incrementos de 1 kb/min.
Cabe señalar aquí que si el tiempo de extensión es demasiado largo, puede producirse una amplificación no específica. Por tanto, es necesario fijar un tiempo de prórroga adecuado.
4. Número de ciclos:
Después de seleccionar otros parámetros, el número de ciclos de PCR depende principalmente de la concentración de ADN molde.
Teóricamente, la acumulación de productos de PCR puede alcanzar el máximo después de 20 a 25 ciclos. En la operación real, el rendimiento de cada reacción no puede alcanzar el 100%, por lo que no importa cuál sea la concentración de la plantilla, de 20 a 30 ciclos es un número de ciclos más razonable. Cuanto mayor sea el número de ciclos, más amplificación inespecífica.
Tecnología de extensión de PCR del verbo (abreviatura de verbo)
Hay muchas tecnologías derivadas de la extensión de PCR. Estas son solo algunas de las que se utilizan comúnmente en los experimentos diarios.
1. Landing PCR
La Landing PCR se utiliza principalmente para optimizar las condiciones de la PCR. En muchos casos, el diseño de los cebadores plantea dificultades a la PCR, como una especificidad insuficiente y una fácil falta de coincidencia. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, la eficiencia de la PCR será demasiado baja, pero si la temperatura de hibridación es demasiado baja, la amplificación no específica será demasiado alta.
Por lo tanto, la temperatura de recocido inicial del ciclo anterior se fija unos grados por encima de la temperatura máxima de fusión (Tm) de la imprimación. Durante los primeros ciclos, la temperatura disminuye gradualmente hasta la Tm final configurada. Después de obtener una plantilla coincidente altamente específica a una temperatura más alta, amplifique eficientemente a una temperatura más baja.
2. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
El principio de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es extraer el ARNm total de tejidos o células, utilizando la transcriptasa inversa. en ADNc utilizando Oligo(dT) o cebadores aleatorios. Luego use ADNc como plantilla para la amplificación por PCR para obtener el gen objetivo o detectar la expresión genética.
3. PCR en tiempo real/PCR cuantitativa
La tecnología de PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real se refiere a la adición de grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, utilizando la acumulación de señales de fluorescencia para monitorear toda la PCR. proceso en tiempo real, y finalmente a través del método de curva estándar para análisis cuantitativo de plantillas desconocidas.
4. PCR anidada
Primero, use cebadores de baja especificidad durante varios ciclos para aumentar el número de plantillas y luego use cebadores de alta especificidad para la amplificación.
5. SOE PCR
La PCR de extensión superpuesta se divide en dos tipos: PCR de extensión superpuesta, mutación dirigida al sitio y mutación por eliminación de secuencia de PCR de extensión superpuesta, es decir, empalme de genes de PCR de extensión superpuesta (SOE). PCR).
5.1 Mutagénesis dirigida al sitio de PCR de extensión superpuesta (debido a que el principio es simple, simplemente vaya a la imagen de arriba).
En este paso se debe utilizar la enzima Pfu, no la enzima Taq, porque la enzima Taq añade fácilmente una A al final del producto de PCR, lo que provocará mutaciones por desplazamiento de marco en el producto.
5.2 Mutación por eliminación de secuencia mediante PCR de extensión de superposición
6 PCR con alto contenido de GC
Tiene un alto contenido de GC (>:65%), debido a G y. Los fuertes enlaces de hidrógeno entre las bases C dificultan la amplificación del molde de ADN. Las secuencias ricas en GC también incluyen estructuras secundarias. Por lo tanto, las secuencias ricas en GC pueden hacer que la ADN polimerasa se "bloquee" a lo largo de la plantilla, interfiriendo con la síntesis de ADN.
Para amplificar fragmentos con alto contenido de GC, la plantilla bicatenaria debe disociarse para que los cebadores puedan unirse a la plantilla y la ADN polimerasa pueda leer la secuencia. Para superar las fuertes interacciones de GC, el enfoque más común es utilizar aditivos de PCR como DMSO o disolventes auxiliares para ayudar a la desnaturalización del ADN. Sin embargo, estos reactivos suelen reducir la Tm de los cebadores, por lo que la temperatura de recocido debe ajustarse en consecuencia.
La ADN polimerasa con alta capacidad sintética es beneficiosa para completar la PCR con alto contenido de GC debido a su mayor capacidad de unión al molde. Las ADN polimerasas termoestables ultraaltas también son beneficiosas para la PCR con alto contenido de GC, ya que temperaturas de desnaturalización más altas (por ejemplo, 98 °C en lugar de 95 °C) pueden promover la disociación de doble cadena y la amplificación por PCR.
7.AS-PCR
La PCR (PCR específica de alelo (AS-PCR)) es un desajuste de bases entre la guía y la plantilla que puede inhibir eficazmente la reacción de PCR, por lo que logrando el propósito de la identificación de la plantilla (identificación de alelos).
Debido a que la extensión del cebador comienza desde el extremo 3' en la PCR, la base en el extremo 3' es muy importante para la extensión del cebador si esta base es complementaria a la base. El cebador se puede extender continuamente y la PCR puede proceder normalmente para obtener una banda amplificada de una longitud específica, por lo tanto, no se puede extender siempre que la base mutante que sea diferente del alelo normal esté dispuesta en la base. Extremo 3' del cebador, cuando contiene una mutación. Cuando se utiliza el cebador de secuencia para PCR, si se obtiene una banda específica, significa que el gen probado contiene la mutación. Si no aparece una banda de amplificación específica, significa que. que no existe tal mutación.
Nota: Debido a que este es solo el caso, se utiliza la falta de coincidencia de bases en el extremo 3' del cebador, por lo que es necesario encontrar una Tm adecuada para lograr la detección. propósito
Referencia
Mullis, Kary B. et al. "Amplificación y detección".