¿Cómo obtienen los microorganismos el ATP que necesitan?
Detección rápida de fluorescencia: la aplicación de biosensores no es un sueño: una entrevista con el profesor Jin Zhenhua, director técnico de Zhongke Maliang Bioengineering Co., Ltd.
El método de fluorescencia ATP es desarrollado basándose en el principio de luminiscencia de luciérnaga. Una tecnología de detección rápida. Las luciérnagas emiten luz porque pueden sintetizar biocatalizadores que convierten la energía química de las sustancias químicas en energía luminosa, como la luciferasa de luciérnaga (luciferasa para abreviar), la D-luciferina y el ATP (trifosfato de adenosina), que todos los organismos celulares pueden producir de materia energética. ). En condiciones aeróbicas, la luciferasa cataliza la luciferina para producir luciferina oxidada, que emite fluorescencia. Si se cumplen las condiciones anteriores, incluso sistemas distintos de las luciérnagas pueden emitir fluorescencia. Ya a finales de la década de 1950, la NASA estableció una tecnología rápida de detección ultramicro de ATP utilizando la luciferasa de luciérnaga. A finales de la década de 1960, se detectó ATP en muestras de suelo de la Tierra y se utilizó para detectar la presencia de vida en la Luna y Marte en el futuro. La aplicación comercial de ensayos de ATP basados en luciferasa de insectos comenzó a finales de la década de 1980, inicialmente mediante el cultivo de larvas de luciérnaga para obtener luciferasa. Con el desarrollo y la aplicación de la tecnología de ingeniería genética, los científicos extrajeron los genes que codifican las enzimas de las luciérnagas de las células de las luciérnagas y los introdujeron en células bacterianas. De esta forma, mediante fermentación biológica se puede obtener una gran cantidad de luciferasa de insecto en apenas una decena de horas.
En 2003, Zhongke Ma Liang presentó el proyecto de patente "Nueva cepa que contiene el gen de la luciferasa y la producción de luciferasa de insectos", inventado por el profesor Jin Zhenhua del Instituto de Desarrollo de la Academia de Ciencias de China. Después de varios años de exploración de la industrialización, finalmente comenzamos la producción en masa de luciferasa de insectos y preparaciones de luciferasa de insectos con derechos de propiedad intelectual independientes después de 2005. En 2007, completamos la comparación de productos de prueba relacionados y logramos rápidamente el número total de bacterias en muestras de alimentos. detección. Principio de detección de fluorescencia de ATP basado en la luciferasa de insectos Sólo cuando hay ATP presente, la luciferasa de insectos puede catalizar la reacción de la luciferasa de insectos y producir fluorescencia. Por tanto, si hay demasiadas luciferasas y enzimas luciferasas, la intensidad de la fluorescencia sólo dependerá de la cantidad de ATP en el sistema de reacción. Tomando como ejemplo la detección de bacterias en una muestra, cuantas más células, más ATP y más fuerte será la fluorescencia. Es decir, bajo ciertas condiciones, el valor de fluorescencia está relacionado linealmente con la cantidad de ATP, además, el valor de fluorescencia se puede medir de manera fácil y precisa con un fotómetro. Por lo tanto, bajo la condición de excluir la interferencia del ATP no bacteriano en la muestra, siempre que se obtenga la curva de relación entre el valor de fluorescencia relativa y el número de células bacterianas, y luego con base en la curva estándar del valor de fluorescencia relativa de ATP puro y el número de células bacterianas, se pueden determinar rápidamente las bacterias de la muestra.
La composición y función del sistema de detección rápida de ATP Actualmente, existen muchos sistemas de aplicación para la detección de biomasa, enzimas y metabolitos basados en el principio de luminiscencia de luciérnaga. Aunque los propósitos de la aplicación, los métodos operativos y las fuentes de muestra de varios sistemas de detección son diferentes, todos incluyen las siguientes partes en su composición.
1. Sistema de reactivos El sistema de reactivos incluye todos los reactivos necesarios para promover reacciones de fluorescencia y reactivos eficaces de extracción de ATP. Específicamente, incluye un juego de reactivos para lisis de células somáticas, un juego de reactivos para lisis de células bacterianas y un juego de reactivos para reacción de fluorescencia. El juego de reactivos para lisis de células somáticas puede lisar específica y eficazmente células no bacterianas (células somáticas) en la muestra y liberar ATP, que luego se elimina a través del filtro en el fondo de la cubeta. La función principal del juego de reactivos para lisis de células bacterianas es lisar eficazmente las células bacterianas y liberar ATP para su detección. Al mismo tiempo, para evitar la degradación del ATP y afectar la autenticidad de los resultados de la prueba, el reactivo de lisis de células bacterianas debería poder inactivar rápidamente las enzimas que degradan el ATP. El conjunto de reactivos fluorescentes incluye luciferina y fluoresceína que interactúan con el ATP bacteriano en la muestra y emiten fluorescencia.
2. Dispositivo de pretratamiento de muestras y muestras. Esta parte incluye un muestreador que puede obtener muestras cuantitativamente para analizarlas en diferentes estados físicos, un presurizador que presuriza el ATP excretado por las células somáticas y una cinta de reacción. portavasos para concentración de muestras y concentradores especiales, etc.
3. Microfotómetro El microfotómetro es un instrumento de detección de fluorescencia en miniatura. Dependiendo de las necesidades específicas, el fotómetro, además de una pantalla para medir y mostrar los valores de fluorescencia, también tiene una interfaz externa que se puede combinar con una computadora personal o una impresora automática para registrar y almacenar datos relevantes para el análisis de tendencias del producto. Control de calidad o higiene.
Ventajas de la tecnología de detección rápida de ATP En términos generales, la detección rápida se basa en que la muestra a analizar sea capaz de producir señales acústicas, ópticas, magnéticas y de otro tipo fáciles de detectar durante el proceso de reacción. La detección rápida de la fluorescencia del ATP se logra produciendo una fluorescencia fácilmente detectable. En términos de seguimiento de la salud, tiene ventajas que las pruebas convencionales no pueden igualar. Tanto la práctica como la literatura muestran que utilizar el valor de fluorescencia detectado por un sistema de detección rápida, es decir, el valor total de ATP (ATP de bacterias y residuos de alimentos) como indicador de seguimiento de la salud, es mejor que la inspección visual o el efecto real, tanto en términos de "oportunidad" y el efecto real. Los recuentos de bacterias en placas son mucho mejores. Por tanto, algunas personas piensan que la cantidad total de ATP puede utilizarse como estándar para juzgar la calidad de la salud.
1. Utilice el método de recuento en placa convencional, rápido y preciso, para detectar el número total de bacterias, incluso si las bacterias crecen en colonias visibles a simple vista en el medio LB. Debido a la dilución desigual de la muestra, una colonia suele estar compuesta por dos o más células bacterianas y el medio LB solo es adecuado para el crecimiento de bacterias aeróbicas o semiaeróbicas. Por lo que sólo se puede obtener el número de este tipo de bacterias.
El método de detección rápida de fluorescencia de ATP puede detectar todas las bacterias, hongos y algas. Los resultados de la detección en tiempo real se pueden obtener en 1 a 5 minutos. La operación es simple y el tiempo es corto. El método de recuento en placas tarda entre 1 y 5 días y los resultados no pueden reflejar la situación higiénica real.
2. El tamaño de la muestra es pequeño. Dado que la luciferasa es muy sensible al ATP y puede detectar menos de 0,1 picomoléculas (10 a 12 moles) de ATP mediante la reacción de luminiscencia, se puede utilizar para detectar muestras con bajo contenido bacteriano. Por ejemplo, el contenido bacteriano en la cerveza esterilizada mediante filtración por membrana de 0,45 µm es muy bajo y no se puede detectar mediante métodos convencionales, pero se puede detectar mediante la concentración de fluorescencia de ATP. La aplicación de la tecnología de detección rápida de ATP "sistema de detección rápida de fluorescencia de ATP" se ha utilizado para el monitoreo de todo el proceso desde la década de 1990. Hay muchos productos que se han desarrollado y comercializado con éxito basándose en el principio de luminiscencia de las luciérnagas. Por ejemplo, el sistema de detección rápida de fluorescencia de ATP desarrollado por Zhongke Ma Liang se puede utilizar para controlar todo el proceso de alimentos, bebidas y productos lácteos: antes de la producción y el procesamiento, se puede utilizar para detectar el efecto de limpieza y desinfección de las instalaciones de producción. y la cantidad total de bacterias en las materias primas durante el proceso de procesamiento y producción. Puede usarse para el monitoreo higiénico de puntos de control clave de los equipos de producción (como el suministro de agua y las válvulas de ventilación) y puede usarse para detectar la cantidad total de bacterias. Microorganismos especiales en bebidas lácteas fermentadas y bebidas alcohólicas. Después del procesamiento y la producción, se puede utilizar para detectar la cantidad total de bacterias contaminantes en los productos terminados. Además, también se puede utilizar para la detección rápida de microorganismos (número total de bacterias) en diversas muestras por parte de organismos encargados de hacer cumplir la ley, como protección ambiental, administración de agua, aduanas y cuarentena. La aplicación de la detección rápida de ATP en HACCP se ha descubierto a través de investigaciones en líneas de producción de alimentos o entornos sanitarios circundantes. Si el número total de bacterias en un determinado punto de la línea de producción obtenida mediante el método de recuento en placa es muy pequeño o estéril, el ATP. valor obtenido por el método de detección de fluorescencia de ATP Si es muy alto, entonces el punto de detección será propenso a criar una gran cantidad de microorganismos más adelante. Después del análisis, se cree que el valor total de ATP obtenido mediante la detección de fluorescencia de ATP proviene de residuos y microorganismos. Y en la mayoría de los casos, la proporción de microorganismos es pequeña. Por lo tanto, podemos utilizar el valor de ATP detectado por la fluorescencia de ATP para determinar si el punto de detección se contaminará nuevamente, en lugar del número total de colonias bacterianas convertidas a partir del valor de ATP de las células bacterianas. Sin embargo, la clave es determinar el ATP crítico. valores de diferentes puntos de detección en diferentes líneas de producción. Con base en esto, los países desarrollados han utilizado la detección de fluorescencia de ATP en HACCP para evaluar si las materias primas alimentarias y las superficies de contacto con materias primas alimentarias limpiadas y desinfectadas cumplen con los estándares higiénicos. Luego concéntrese en monitorear las partes clave que son propensas a la contaminación microbiana. Por ejemplo, mediante la detección rápida de ATP, se puede determinar si existe alguna posibilidad de contaminación durante el intervalo desde la desinfección de rutina hasta la nueva producción y luego se puede formular un rango de valores de ATP que sea consistente con las condiciones y requisitos higiénicos de la unidad; . Aplicación del probador rápido de ATP de bolsillo En la actualidad, el probador rápido de ATP de bolsillo se ha utilizado en todos los aspectos de la vida. Su aplicación en alimentos es principalmente para detectar el estado de higiene de la vajilla en restaurantes y trenes. El Ministerio de Ferrocarriles de China ha decidido utilizar el probador rápido portátil de Shenyang Zhongke Maliang Bioengineering Co., Ltd. en trenes para reemplazar el método de detección indirecta de iones de cloruro para la inspección de la higiene de la vajilla antes de los Juegos Olímpicos de 2008. Además, la detección rápida de ATP basada en luciferasa también se puede aplicar a otros campos y usos, como pruebas de agua del grifo, pruebas de esterilidad del agua embotellada, detección de ántrax en dietas de campo militares, monitoreo ambiental, pruebas clínicas, etc.