El desarrollo del principio de Coulter
En una primera fase, el deseo de Wallace de transformar el trabajo rutinario de contar los glóbulos rojos en una operación automatizada llevó a la formulación de la idea simple descrita anteriormente, la definición del principio de Coulter, cuya patente fue obtenido y respaldado por los Institutos Nacionales de Salud y los principios fueron explicados en un simposio nacional en los Estados Unidos.
En la segunda fase, los hermanos Coulter se centraron en la practicidad de los instrumentos comerciales, centrándose en apoyar la producción y venta de dichos instrumentos a través de empresas operativas.
En la tercera etapa, se estudiaron exhaustivamente los errores de medición de volumen causados por las propiedades funcionales del orificio sensor. La creciente empresa de Kurt Brothers encontró varias soluciones, lo que dio como resultado el desarrollo de un analizador de sangre cada vez más automatizado. Después de adquirir experiencia técnica en otros lugares, Wallace regresó a Chicago en 1946, tras lo cual invitó a su hermano, Joseph R. Coulter, Jr., a unirse a él en su investigación.
Más tarde recordó su trabajo en un laboratorio en un sótano: "El primer método fue contar las células sanguíneas que pasaban a través de los capilares y haces, como contar el número de personas que caminan por un pasillo. Pero no lo hicimos. Bueno, nos preguntamos por qué. ¿Existe alguna otra forma de generar una señal de pulso eléctrico a través de la acción de transmisión de una célula además de ajustar el haz? "Aunque no sabíamos la respuesta en ese momento, las células sanguíneas son aislantes. ¿Así que hicimos esto ajustando la corriente eléctrica?" En cambio, el rayo obtuvo la solución. Con una solución esencialmente simple, Wallace redujo la longitud de los capilares al mínimo en 1947.
"Al principio no teníamos mucho dinero. Sacamos un trozo de celofán de la pitillera y le hicimos un pequeño agujero con una aguja caliente. Aunque el pequeño agujero no duró mucho, Contamos. Se quitaron algunas células". Se fijó el celofán con pequeños agujeros y se cubrió el extremo del tubo de vidrio mediante un anillo de goma, y se separaron los dos electrodos conectados a la fuente de alimentación. Las células suspendidas en el medio iónico y el El correntímetro fluía a través del celofán con pequeños agujeros. El desplazamiento de fluido de la celda en el poro (igual a su propio volumen) es proporcional al pulso de voltaje entre los dos electrodos que conducen corriente a través del poro.
Los hermanos Coulter descubrieron que el contraste eléctrico entre las células y el medio de suspensión era 10 veces mayor que el obtenido mediante métodos fotoeléctricos. Los pulsos de voltaje generados podían contar con precisión el número de partículas en la suspensión que fluían a través de las células. poros. Este descubrimiento llevó a Wallace a pasar mucho tiempo buscando un abogado dispuesto a solicitar una patente. Finalmente, en 1948, le presentaron a Irving Silverman y reconoció el potencial de este nuevo método. En 1949 se presentó una solicitud de patente.
Pero los examinadores de patentes también dudaban de que un agujero pudiera patentarse. Afortunadamente, supuso que si se pudieran proporcionar algunos ejemplos de aplicación (en lugar de simplemente el principio de "corriente axial que pasa a través de un pequeño orificio y un canal de detección"), se podría obtener un método basado en el principio de detectar partículas en un canal de corriente estrecho. patente. 1 describe los canales simulados a través del flujo suspendido en un pequeño orificio, y también describe pequeños orificios con secciones transversales no circulares. Otro ejemplo es el uso de una aguja aislada para buscar partículas que pasan en una suspensión estable; la presencia de partículas se detecta mediante un pulso de corriente entre la aguja en movimiento y otro electrodo en contacto con el medio de suspensión conductor. Se definió un nuevo principio Coulter y hace 50 años, el 20 de octubre de 1953, se concedió una patente innovadora. El pequeño orificio formado en la parte inferior de la pared interior del tubo de ensayo es el primer ejemplo de esta patente.
Mientras tanto, los hermanos Coulter continuaron su investigación y desarrollo, centrándose en hacer viable la automatización. Con la ayuda gratuita de Walter Hogg (un amigo de Joseph en el ejército), los hermanos Coulter ensamblaron un aparato experimental (un proyecto por contrato con la Oficina de Investigación Naval): un sistema de medición mecánico que impulsa un flujo controlado de suspensión celular a través de un pequeño orificio. Mientras un dispositivo de conexión le suministra corriente, el impulso de señal resultante es detectado por un amplificador de tensión con un umbral ajustable. Los pulsos de señal que exceden el umbral activarán un contador de pulsos (Berkeley Scientific Model 410; Beckman Instruments, Richmond, CA. Al aumentar sucesivamente el umbral y probar muestras repetidamente, la distribución acumulativa de los tamaños de celda se puede registrar manualmente, ya que se requiere monitoreo). el pequeño orificio está parcialmente bloqueado y se instala un osciloscopio para monitorear el pulso de la señal y el ajuste del umbral al mismo tiempo. En 1956, Wallace anunció oficialmente el principio de Coulter en un artículo técnico personal. En el contador, las células individuales pasan a través de un pequeño y estrecho. ruta de la corriente en una suspensión, y se detecta la diferencia en sus respectivas conductividades entre las células y la suspensión. La ruta de la corriente pequeña y estrecha es similar a un solo haz pequeño en un sistema óptico, ya que las células sanguíneas pasan a través de una ruta de corriente pequeña. un fluido, cambian la resistencia en el circuito, provocando un cambio en la caída de voltaje a lo largo del camino de la corriente. Los caminos de corriente a pequeña escala y el flujo de fluido que contiene las células que fluyen a través de ellos tienen una estructura simple. pequeño orificio sumergido en la pared interior de un contenedor aislado "En la Figura 3, el orificio sumergido es el orificio central en la placa circular perforada A
Poco después, los Institutos Nacionales de Salud. Se publicaron dos informes de evaluación. publicado.
Tanto el informe de agosto como el de septiembre concluyeron que el método de Kurt mejoraba la precisión, eficacia y conveniencia del recuento de glóbulos rojos. ¿La revista que publicó una de las reseñas también hizo un nuevo contador Coulter? Primer anuncio. Otro informe de evaluación9 sugirió que la desviación de la distribución del tamaño de las partículas se debe a una coincidencia celular y proporcionó un método artificial para corregir la pérdida de recuento causada por la coincidencia. También contiene datos preliminares sobre el recuento de glóbulos blancos.
Se ha demostrado la viabilidad de automatizar análisis de sangre vitales, pero aún no se ha iniciado su operación comercial. Todavía es difícil asegurar el pequeño agujero de forma segura. 10 También es motivo de preocupación el mercurio utilizado en los manómetros (utilizados para medir los sólidos en suspensión después de pasar por pequeños orificios), especialmente el sistema mecánico del contador experimental. La fuente de voltaje utilizada para proporcionar corriente de excitación a los pocillos tiene una sensibilidad inaceptable a las características de los pocillos y al medio utilizado para suspender las células. En estudios realizados por los Institutos Nacionales de Salud, se ha demostrado la necesidad de diluyentes automatizados para diluir muestras con precisión. Joseph resumió los preparativos diciendo: "Sabemos que todavía hay muchas preguntas, pero ya sabemos algunas cosas útiles. La próxima década está a punto de comenzar, y las soluciones a estos problemas pronto estarán disponibles en las solicitudes de patente recién presentadas". . El núcleo del contador Coulter es el orificio sensor (consulte la Figura 3, el orificio en la oblea A), que atrae la mayor atención de los hermanos Coulter en este momento. Para muchas aplicaciones potenciales, se requieren diámetros de orificios inferiores a 100 μm, con tolerancias muy estrictas en cuanto a tamaño y forma. Perforar directamente pequeños agujeros en la pared del tubo de ensayo de muestra tiene una baja repetibilidad, lo que lleva a experimentos con discos de vidrio perforados (que forman secciones transversales capilares). El adhesivo utilizado para asegurar la oblea no tuvo éxito (ineficaz) y si se soldaran orificios al tubo de muestra, el calor los deformaría. También se probaron anillos de piedras preciosas para usar como cojinetes de relojes, y Hermann Foery (una empresa de joyería suiza con sede en Locarno, Suiza) proporcionó piedras preciosas experimentales para hacer los primeros agujeros silenciosos. En colaboración con Sam Gutilla (Del Mar Scientific, Chicago, IL, EE. UU.), se desarrolló un método para soldar piedras preciosas a tubos de muestra. Los precisos orificios cilíndricos de la piedra no se ven afectados por la soldadura y proporcionan conductos duraderos para la corriente eléctrica y la suspensión de muestras.
A finales de 1958, se patentó el tubo de muestra intercambiable (ver B en la Figura 3) soldado a la piedra preciosa del anillo. El espesor de la piedra preciosa se seleccionó para proporcionar una relación longitud-diámetro del agujero de aproximadamente 0,75, lo que minimiza la superposición de partículas observada en la patente subyacente 4 y en el estudio de los NIH 9 . En 1958, los hermanos Kurt se estaban preparando para formar Kurt Electronics Corporation y Kurt Sales Company. Los dos primeros empleados de tiempo completo de la empresa matriz fueron Joseph R. Kurt Jr. y Walter Hogg, quienes brindaron servicio voluntario a largo plazo. Al principio, el padre del hermano Kurt venía a la empresa a tiempo parcial los fines de semana para trabajar como secretario y contable, pero en ese momento ya tenía 68 años. Se jubiló como operador ferroviario y trabajó con sus hijos hasta 1971. Walter fue el primer empleado que permaneció en la empresa durante 20 años. Ha sido nombrado inventor en más patentes estadounidenses que Wallace (95 patentes frente a 82 patentes, respectivamente). Walter también era el único empleado de la empresa con más patentes que Wallace.
En retrospectiva, 1958 fue un punto de partida importante. Kilby inventó el oscilador, el primer circuito integrado. Pronto, Noyce y Herney desarrollaron la tecnología plana, que condujo al rápido desarrollo de la microelectrónica. Townes y Schawlow describieron los requisitos para que los másers funcionen en frecuencias ópticas. Dos años después, Maiman descubrió el láser. Todos estos acontecimientos jugaron un papel decisivo en el futuro de la nueva empresa.
Inicialmente, Ernie Yasaka montó una réplica del Prototipo 14, ahora conocido como Modelo A Coulter Counter. , a la venta en Wallace. Para uso industrial15, se añadió un agitador a la etapa de muestra (ver Figura 4). A lo que las nuevas empresas deben prestar atención de inmediato es a un artículo que demuestra una correlación positiva entre la amplitud del pulso y el volumen de partículas. ¿Colocando un contador de Kurt? Y conectado a un analizador de altura de pulso (PHA) de un solo canal con umbrales de pulso variables duales, Kubitschek obtuvo la primera distribución diferencial del tamaño de partículas. De esta manera, se destacan dos deficiencias del contador Tipo A: primero, su umbral único requiere múltiples pruebas elevando continuamente el umbral para obtener la distribución de tamaño de partícula acumulada de 14 y 16, y obtener manualmente la distribución de tamaño de partícula diferencial requiere una gran cantidad de pruebas. cantidad de trabajo. Claramente, existe una gran necesidad de métodos automatizados de análisis del tamaño de partículas; una segunda desventaja es que la fuente de voltaje utilizada para proporcionar la corriente del orificio hace que la amplitud del pulso sea sensible al tamaño del orificio específico, la resistividad del medio de suspensión específico, y cambios inducidos por la temperatura en el medio de suspensión específico, lo que complica el recuento preciso y el análisis del tamaño de partículas.
Figura 4 Contador Coulter con plataforma de muestra industrial (Figura 3), como se muestra a la derecha. El objeto redondo negro en la parte superior derecha de la plataforma de muestra es el motor de agitación, que se usa para mantener suspendidas las partículas industriales al contar células sanguíneas; el agitador no se usa en el soporte de muestra; La consola incluye, de izquierda a derecha, un contador mecánico (dígitos de alto valor para una acumulación lenta), tres contadores decimales (dígitos de bajo valor para una acumulación rápida) y un tubo de visualización de osciloscopio. Los controles de corriente de umbral único y de orificio estenopeico se controlan mediante pantalla.
Después de lograr buenos resultados con el recuento de glóbulos blancos, la empresa introdujo en la década de 1960 un instrumento mejorado diseñado para medir aún más el tamaño de las células y las partículas con mayor precisión.
Se utiliza una fuente de corriente para reemplazar la fuente de voltaje original para excitar el orificio, y se usa un amplificador sensible a la corriente de umbral dual para reemplazar el amplificador de voltaje de umbral único original para detectar el pulso de la partícula. Por lo tanto, el contador Coulter tipo B es insensible a los factores que limitan los contadores tipo A, y sus enclavamientos de umbral dual forman un canal extraíble controlado por un temporizador secuencial de cuatro segundos. Su trazador de distribución tipo H adjunto 20 puede acumular automáticamente 25 canales de distribución diferencial de tamaño de partículas a partir de una operación de muestra de 100 segundos. También se han logrado avances en el contador Coulter tipo C, cuyo prototipo incluye un analizador de altura de pulso de 12 canales. Sus más de 350 tubos de vacío calientan las instalaciones de la empresa y es tan grande que hay que desmontarlo para su transporte. En 1961, la empresa se había mudado de Chicago a Hialeah, Florida, y el mostrador Modelo C Coulter era lo suficientemente pequeño como para caber sobre una mesa.
En la década de 1960, los contadores tipo A y B demostraron ser muy útiles para contar y dimensionar glóbulos rojos y blancos7,18,22–28 (ver revisiones 25 y 27), y también se utilizan análisis del tamaño de partículas. utilizado en microbiología e industria31. Pero también hay preocupaciones. En 1959, se diseñó un instrumento comercial basado en el principio de Coulter. En 1960 se confirmó la distribución asimétrica encontrada en un estudio de los Institutos Nacionales de Salud. Los voluminosos diluyentes impulsaron a los clientes a diseñar ellos mismos mejores instrumentos. 1962, descubrió que la relación de aspecto del orificio sensor afectaba la resolución del análisis del tamaño de partículas. Una empresa (más tarde competidora de Coulter Brothers) patentó un derivado del principio de Coulter, y un ejecutivo de Coulter Sales Company que luego dejó Coulter patentó él mismo una empresa de tubos de muestra derivados, convirtiéndose en un competidor de Coulter Corporation. Además, los primeros experimentos de recuento de plaquetas encontraron interferencias inesperadas, aparentemente procedentes de pequeñas partículas que no eran detectables mediante microscopía de fase38.
Lushbaugh et al. utilizaron contadores Coulter tipo A 39 y 40 para conectarse a un PHA de 100 canales, lo que aumentó el costo de medición. Pronto, varias empresas estaban conectando sensores de partículas Coulter especialmente diseñados a PHA comerciales, que podían proporcionar hasta 512 canales. A medida que aumenta la disponibilidad y sofisticación de las herramientas de medición volumétrica, se hace cada vez más evidente el uso de herramientas manuales para medir la distribución de tamaño de diversas células y partículas. Wallace comentó: "Es bueno tener desafíos y definitivamente compartiremos algunos de los beneficios". Los orificios de detección (consulte los orificios en el disco perforado en la Figura 3) son el núcleo del principio de Coulter y del diseño de un contador Coulter. Complementar automáticamente su funcionalidad se convierte en una máxima prioridad. Una investigación de los Institutos Nacionales de Salud señaló que la sensibilidad del orificio de detección es tres veces mayor que la del orificio geométrico, que es el resultado del campo eléctrico generado por la corriente de excitación que fluye a través del recipiente de muestra y el medio suspendido en el tubo de muestra. (ver Figura 3). Un campo hidrodinámico similar generado por el sistema de medición hace que las células (o partículas) interactúen con el campo eléctrico a medida que pasan a través de la apertura de detección. Para ambos campos de orificios, se producen interacciones significativas de partículas dentro del volumen sensible que contiene el orificio de detección y se extienden hacia afuera en una forma semielíptica desde la entrada y salida del orificio hasta una distancia de tres a cuatro veces el diámetro del orificio.
Así, al liberar el mismo volumen de medio de suspensión conductor que la celda, cada celda distorsiona el campo eléctrico dentro de sus límites, particularmente cuando pasa a través de la apertura de detección. Por tanto, el volumen de la célula es equivalente al volumen del poro. Los cambios en la resistencia de un agujero pequeño (generalmente 1 en 50.000) y el pequeño cambio en la resistencia al pasar a través del agujero generan pulsos de señal que permiten el recuento de células y la medición del tamaño. Para lograr un conteo preciso y mediciones de tamaño repetibles, se requiere que el flujo suspendido a través de los pequeños orificios sea muy estable. A diferencia del flujo de iones, el flujo de suspensión se ve afectado por la inercia de la superficie y la capa límite del orificio sensor debido a la agregación y la viscosidad del medio de suspensión. Como resultado, estos pares de agujeros y sus dos orificios producen reacciones microgeométricas 50 y producen un campo de flujo dinámico asimétrico alrededor del punto central del eje del agujero. El flujo anular creado en el orificio de salida devuelve las partículas al volumen de detección del pequeño orificio, lo que generará un pulso secundario y provocará resultados erróneos en el conteo de partículas. Por ejemplo, en sus primeros trabajos sobre plaquetas, Walter Haug descubrió 38 que las partículas erróneas encontradas eran glóbulos rojos que volvían a entrar en el volumen de detección, y un segundo pulso hizo que volvieran a contarse como plaquetas. El flujo auxiliar que aleja las partículas del orificio de salida evita la circulación de partículas y la pulsación secundaria.
Se ha pensado que cuando un volumen sensible de células pasa a través de un microporo simultáneamente, el impulso a través de partículas protegidas reducirá el recuento de células, pero la pérdida de recuento puede predecirse estadísticamente mediante la concentración de células en la suspensión. Por lo tanto, los recuentos de un solo canal se pueden corregir automáticamente con los circuitos adecuados61. Este método se introdujo en la última versión del contador D-Type Coulter. Sin embargo, los pulsos atípicos generados por el paso simultáneo de partículas también conducen a una ampliación de la distribución del tamaño de las partículas45, y la distribución típica del tamaño de las partículas de los glóbulos rojos es asimétrica39–41,44,62. En el estudio del NIH, esta asimetría se clasificó como coincidencia de partículas, pero se descubrió rápidamente en otros tipos de células y distribuciones de tamaño de partículas. Después de mejorar la precisión del volumen medido, se determinó que la distribución del tamaño de partículas de los glóbulos rojos era bimodal 40, 465, 438 + 0, 65. Todos estos artefactos de distribución dan como resultado una resolución reducida de las mediciones dimensionales. A finales de la década de 1960, la investigación sobre las causas de las ilusiones en la medición de volumen se desarrolló rápidamente y varios institutos establecieron sistemas experimentales basados en el principio de Coulter.
Pueden ocurrir artefactos problemáticos en la distribución del tamaño de partículas cuando las partículas pasan a través del orificio de detección a diferentes distancias radiales del eje. A bajas concentraciones de partículas efectivas, orificios pequeños de varias veces la longitud del orificio pueden mejorar la resolución de medición34,465,438+0,67,80, y el flujo auxiliar alrededor del flujo suspendido más pequeño se puede concentrar de manera hidrodinámica cerca del eje con partículas pequeñas. agujeros. En concentraciones típicas de partículas, muestrear el pulso de la señal en el centro de la apertura o seleccionar el pulso de la señal según su duración puede mejorar en gran medida la precisión de la determinación del volumen (consulte la descripción general 65, 67, 78, 86–88). Un resultado importante del estudio de las propiedades funcionales de los microporos fue la invención del primer clasificador de células48,70,89–91, que puede determinar si la distribución bimodal de los glóbulos rojos es un hecho o un artefacto. Fulwyler combinó los principios de Kurt con la tecnología de inyección de tinta y la utilizó para seleccionar células de un único patrón de distribución. Cuando se cambió el tamaño de los glóbulos rojos seleccionados, resultó que la forma bimodal original era una ilusión. En un avance importante de esta investigación, el modelo del contador Coulter evolucionó con el desarrollo de la electrónica, reemplazando simultáneamente el tipo A por el tipo F y el tipo C del transistor. La hoja de muestra se ha modificado para reemplazar el trazador distribuido tipo H por un trazador distribuido tipo J. En la segunda mitad de 1968, apareció el primer analizador de sangre completamente automático, el contador Coulter tipo S de parámetro 94-7. . Mientras tanto, ¿el contador de transistores T-Coulter? ¿En lugar de un contador de rejas tipo C? Para fines industriales. Basado en circuitos integrados, el contador de la serie Z se lanzó en 1970. ¿Chanlyzer apareció en 1972? Para los analizadores de volumen, aparecieron al mismo tiempo los analizadores industriales de la serie TA, que incluían contadores y circuitos PHA de 16 canales. Poco después, estos instrumentos empezaron a utilizar microprocesadores.
Wallace comentaba a menudo1: "Mientras funcione, la gente lo comprará". A medida que el producto sigue mejorando, las ventas aumentan. La serie Multisizer producida después de 2000 tiene una posición insustituible en los campos industrial, biológico y otros, porque este modelo tiene una resolución extremadamente alta y puede analizar de forma independiente la señal de pulso de una sola partícula basándose en su procesador DPP recientemente desarrollado, lo que hace que todo el proceso sea posible monitorear cambios en el volumen o tamaño de partículas o células. El nacimiento de la tecnología de procesador de pulsos también ha agregado capacidades únicas de monitoreo de procesos al campo de los analizadores de tamaño de partículas (Figura 5).
Figura 5: Los analizadores de tamaño de partículas y recuento de Coulter Multisizer 3 se utilizan actualmente ampliamente en diversas industrias.
La implementación axial del principio de Coulter ha recibido una amplia atención hasta ahora, pero los esfuerzos por reducir su tamaño se han topado con un cuello de botella debido al ruido térmico. En principio, la segunda forma utiliza excitación y detección a través del flujo suspendido, lo que permite detectar partículas más pequeñas, pero a expensas de la linealización del volumen (según la forma elegida de los poros y electrodos). Queda por ver si la cuarta fase de desarrollo del Principio Coulter incluye lo anterior, o una combinación de tecnologías emergentes con las existentes.
Una persona tiene suerte de tener un buen profesor. Los que tuvieron la suerte de trabajar con el hermano Coulter tuvieron dos mentores. Este breve artículo de revisión tiene como objetivo conmemorar a los hermanos destacados a quienes siempre les gusta trabajar duro y animarse a hacerlo mejor.