Cómo cultivar el virus de la influenza

1 Células utilizadas para cultivar el virus de la influenza 1? 1 Selección de líneas celulares Los embriones de pollo se utilizan cuando se cultivan inicialmente los virus de la influenza, pero el aislamiento de los virus de la influenza a partir de embriones de pollo puede causar fácilmente mutaciones del virus y reacciones alérgicas, y puede causar también causa Existe un problema de contaminación de virus exógenos durante la producción a gran escala. El uso de células Vero y MDCK para cultivar virus de la influenza no sólo resuelve los problemas anteriores, sino que también hace que el inmunógeno del virus sea más estable. Qi Fengchun[1] et al. descubrieron que, en las mismas condiciones experimentales, el título de HA de los virus cultivados en células MDCK era significativamente mayor que el de las células Vero. Por lo tanto, cuando cultivamos líneas celulares del virus de la influenza, elegimos células MDCK, cuyas líneas celulares se cultivan. El número de pases es preferiblemente inferior a 35 generaciones, las células que son demasiado viejas harán que sea más difícil para el virus cargarse. 1?2 La edad celular óptima para cargar virus son las células MDCK. Se reproducen muy vigorosamente. Las células del matraz de cultivo celular deben inocularse en una placa de seis pocillos con un día de antelación. se utilizan para cargar el virus, entonces la tasa positiva de cultivo de virus es casi 0, mientras que la tasa positiva de carga de virus en células MDCK con una edad celular de 12 a 24 horas no es muy diferente [2]. 1?3 La densidad óptima para que las células carguen virus En primer lugar, la densidad de las células MDCK no debe ser demasiado delgada. Si la densidad de las células MDCK es demasiado delgada, no podrán crecer y las células no deberían. amontonarse densamente. Esto también reducirá en gran medida la tasa de positividad de la inoculación del virus. Es mejor hacer que las células cubran el pocillo. En este momento, el título de HA del virus recolectado después de cargar el virus es el más alto. Cuando los trabajadores inoculan células en una placa de 6 pocillos con un día de antelación, se debe considerar la tasa de crecimiento de las células para garantizar que la densidad celular sea adecuada al cargar el virus al día siguiente. En segundo lugar, cuando se inoculan células MDCK en una placa de seis pocillos, la densidad debe ser uniforme. Es fácil que las células se acumulen en el borde del pocillo y la densidad en el medio sea demasiado fina, lo que también afectará. la tasa positiva de carga viral. Para evitar esta situación, el personal debe ser capacitado. Si se produce esta situación, agitar suavemente la placa de cultivo (para evitar salpicaduras de líquido) puede mejorar eficazmente la distribución de las células. 2. Reactivos para cultivar virus de influenza Los diferentes reactivos utilizados para cultivar virus de influenza también afectarán en gran medida la tasa positiva de cultivo de virus. En primer lugar, no utilice reactivos caducados; en segundo lugar, es mejor utilizar reactivos de fabricantes conocidos, como GIBCO. En tercer lugar, saque los reactivos del frigorífico durante un tiempo antes de usarlos; espere hasta que la temperatura de los reactivos se haya equilibrado a la temperatura ambiente antes de usarlos. Si se reemplazan las células, los reactivos súper fríos afectarán el estado de crecimiento de las células; si las células se lavan antes de cargar el virus, los reactivos súper fríos harán que las células se encojan repentinamente y reduzcan la tasa positiva del cultivo del virus. 3 Muestras 3.1 Almacenamiento de muestras El tiempo de almacenamiento de las muestras afecta directamente la tasa positiva de carga viral. Cuanto más fresca sea la muestra, mayor será la tasa positiva del cultivo viral. Si la muestra no puede cargar las células a tiempo, la muestra debe colocarse en un refrigerador a -70ºC para evitar la congelación y descongelación repetidas. Cuanto más tiempo de congelación y descongelación, menor será la tasa positiva de cultivo de virus. Tenga en cuenta que las muestras no se pueden colocar en un refrigerador a -20°C. Los virus de la influenza son muy inestables a -20°C. Si las muestras del día no se pueden inocular hasta el día siguiente, las muestras se deben colocar en un refrigerador a 4°C. °C. 3.2 Procesamiento aséptico de las muestras Debido a que las condiciones de muestreo de las muestras no pueden ser estériles, aunque hay antibióticos en la solución de muestreo, no se puede garantizar que se eliminen todas las bacterias, por lo que es mejor filtrar las muestras positivas en una centrífuga estéril de 1,5 ml. tubo de repuesto. Algunos trabajadores agregan antibióticos a las placas de cultivo celular para evitar la contaminación. Aunque esto evita problemas, dañará las células y reducirá la tasa positiva de cultivo de virus. 4 pasos de carga de virus 4?1 Lavado de células Vierta el medio de cultivo celular en la placa de seis pocillos y lave cada pocillo con HBSS más de tres veces. Su función es eliminar el FBS residual que inhibe la influenza al inhibir la replicación. de virus. Después de verter la solución de lavado, agregue la solución de lavado o la solución de virus inmediatamente. Exponer las células al aire durante demasiado tiempo reducirá en gran medida la tasa positiva del cultivo de virus. Es mejor acortar el tiempo que las células están expuestas al aire. 5 segundos. 4?2 La cantidad de inoculación de líquido viral La inoculación de líquido viral es muy particular. El líquido viral cargado en las células debe ser superior a 300u,l, de lo contrario no será suficiente para cubrir todo el pocillo de células. Después de 1 a 2 horas de incubación a 37ºC, sin importar cuánto volumen de líquido viral se cargue inicialmente, se deben dejar 300 ul de líquido viral en cada pocillo antes de agregar el medio de cultivo viral si se desecha todo el líquido viral o se descarta muy poco. Si se retiene demasiado líquido viral, por ejemplo más de 400 u, la tasa positiva también se reducirá considerablemente, porque retener demasiado virus defectuoso afectará gravemente el cultivo del virus. replicación de virus normales. 4.3 Tiempo de incubación del líquido viral Teóricamente, el líquido viral se puede incubar a 37 °C durante 1 a 2 horas, pero descubrimos que 1 hora todavía es demasiado corta. Lo mejor es agregar el medio de cultivo viral después de 1 hora y 15 minutos. No demore demasiado, lo que también provocará que el virus se incube. La disminución en la tasa positiva de cultivo puede deberse a que el valor de pH de la solución de muestreo es diferente al del medio de cultivo del virus y la incubación es un poco más larga. El tiempo puede causar daño a las células. En la transferencia ciega, el tiempo de incubación puede ser de más de 2 horas, porque el líquido viral utilizado en este momento también es un medio de cultivo viral, no un líquido de muestreo. 4.4 Preparación del medio de cultivo de virus El medio de cultivo de virus se prepara añadiendo DMEM, HEPES y tripsina. La función de HEPES es mejorar la capacidad tampón del sistema. La función de la tripsina es convertir el HA0 no escindido de las partículas de virus. en HA0 escindido Tipo HA1+HA2, mejorando así la capacidad del virus de la influenza para replicarse en las células, porque el virus de la influenza es infeccioso solo si se escinde la hemaglutinina (H).

Sin embargo, almacenar HEPES y tripsina en DMEM durante demasiado tiempo a 4!*** hará que el valor del pH aumente, por lo que generalmente preparamos el medio de cultivo de virus para su uso inmediato. 4.5 Determinación del título de HA del virus El tiempo de aparición del CPE varía según el tipo y cepa del virus y el tamaño de la infección. Observaremos si se produce CPE en la muestra 3 días después de la inoculación. Si se produce CPE, se medirá el título de HA. Si el título es superior a 8, se recolectará el subtipo de virus. el título del virus es inferior a 8, se realizará la transmisión ciega. Luego se medirá HA el tercer día. Si el CPE no aparece dentro de los 7 días posteriores a la carga del virus y no se puede detectar actividad de HA en la solución de mantenimiento, la muestra se puede considerar negativa y descartarse. El pico más alto del título de virus apareció en 3d, y tanto 4d como 2d fueron más bajos que el título de virus en 3d. Antes de cosechar las cepas de virus, congele y descongele las células una vez a -80°C/37°C para ayudar a aumentar el título de HA del virus.