¿Cómo diseñar y construir un vector para que el gen objetivo se exprese en las raíces de las plantas y se secrete a partir de las células de las raíces?

Construir genes extraños específicos en vectores de expresión de plantas y transferirlos a plantas receptoras no es el objetivo final de la transformación genética de plantas. Las plantas transgénicas ideales generalmente requieren una expresión de alto nivel de genes exógenos en sitios específicos y dentro de un tiempo específico para producir los rasgos fenotípicos deseados. Sin embargo, la historia del desarrollo de las últimas dos décadas muestra que a menudo aparecen genes extraños en las plantas receptoras, como baja eficiencia de expresión, productos de expresión inestables o incluso inactivación o silenciamiento de genes, lo que hace que las plantas transgénicas no puedan ponerse en uso práctico. Además, la seguridad de las plantas genéticamente modificadas ha causado preocupación en muchos países. Por ejemplo, las plantas genéticamente modificadas pueden transmitirse con el polen y los genes marcadores de detección de antibióticos pueden hacer que algunos antibióticos clínicos sean ineficaces. La aparición de los problemas antes mencionados ha puesto a la ingeniería genética vegetal de alta tecnología en un período difícil sin precedentes. Para resolver estos problemas, la gente ha explorado y mejorado la tecnología transgénica de plantas en muchos aspectos en los últimos años, y la mejora y optimización de los vectores de expresión de plantas es uno de los contenidos más importantes. Este artículo resume los avances que se han logrado.

1 Selección y transformación del promotor

La expresión insuficiente de genes exógenos es a menudo una razón importante por la que no se pueden obtener plantas transgénicas ideales. Debido a que los promotores desempeñan un papel clave en la determinación de la expresión genética, la primera consideración es seleccionar un promotor vegetal apropiado y aumentar su actividad.

En la actualidad, los promotores más utilizados en los vectores de expresión vegetales son los promotores constitutivos. Por ejemplo, la mayoría de las plantas transgénicas dicotiledóneas utilizan el promotor CaMV35S, mientras que las plantas transgénicas monocotiledóneas utilizan principalmente el promotor ubiquitina del maíz y el promotor Actinl del arroz. Bajo el control de estos promotores expresados ​​constitutivamente, los genes extraños se expresarán en todas las partes de la planta transgénica y en todas las etapas de desarrollo. Sin embargo, la expresión continua de alta eficiencia de genes extraños en plantas receptoras no solo causa desperdicio, sino que a menudo también causa cambios morfológicos en las plantas y afecta su crecimiento y desarrollo. Para que los genes extraños desempeñen un papel eficaz en las plantas y reduzcan los efectos adversos en las plantas, la gente está prestando cada vez más atención a la investigación y aplicación de promotores de expresión específicos. Los promotores específicos descubiertos incluyen principalmente promotores específicos de órganos y promotores específicos de inducción. Por ejemplo, promotores específicos de semillas, promotores específicos de frutas, promotores específicos de células del mesófilo, promotores específicos de raíces, promotores inducidos por lesiones, promotores inducidos químicamente, promotores inducidos por luz, promotores inducidos por choque térmico, etc. La clonación y aplicación de estos promotores específicos sienta las bases para la expresión específica de genes extraños en plantas. Por ejemplo, la empresa suiza CIBA-Gage utiliza el promotor PR-IA para controlar la expresión de genes de la toxina Bt en tabaco transgénico. Dado que el promotor puede ser inducido por ácido salicílico y sus derivados, obviamente es un método muy eficaz para inducir la expresión de genes resistentes a insectos mediante la pulverización de productos químicos baratos y no contaminantes durante la temporada en la que reaparecen las plagas.

En la investigación de plantas transgénicas, a menudo es imposible obtener resultados satisfactorios utilizando promotores naturales. Especialmente cuando se realiza expresión específica y expresión inducida, el nivel de expresión es mayoritariamente insatisfactorio. Transformar los promotores existentes y construir promotores compuestos será un enfoque muy importante. Por ejemplo, Ni et al. combinaron la región de activación de la transcripción del promotor del gen de la octopina sintasa con el promotor del gen de la manolina sintasa. Los resultados de la expresión de GUS mostraron que la actividad del promotor modificado era significativamente mayor que la del promotor 35S. Wu Rui et al. combinaron el promotor del gen PI-II inducible con el intrón 1 del gen Actinl del arroz y la actividad de expresión del nuevo promotor aumentó casi 10 veces (patente). Estos promotores artificiales desempeñan un papel importante en la investigación en ingeniería genética vegetal.

2. Mejorar la eficiencia de la traducción

Para mejorar la eficiencia de la traducción de genes extraños, los genes generalmente deben modificarse al construir vectores. Se deben considerar tres aspectos principales:

2.1 agrega la secuencia 5′-3′-no traducida.

Muchos experimentos han descubierto que la secuencia no traducida (UTR) 5′-3′ de genes eucarióticos es muy necesaria para la expresión normal de los genes. La eliminación de este segmento a menudo conduce a la estabilidad del ARNm y a los niveles de traducción. . descenso significativo. Por ejemplo, existe un elemento ω que consta de nucleótidos de 68 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción del gen proteico de 126 kda del virus del mosaico del tabaco (TMV), que proporciona un nuevo sitio de unión para los ribosomas y puede mejorar la actividad de traducción del Gus. gen varias veces. Actualmente, muchos vectores añaden secuencias potenciadoras de la traducción ω al extremo 5' de genes exógenos. Ingelbrecht et al. estudiaron las secuencias del extremo 3' de muchos genes y descubrieron que la secuencia del extremo 3' del gen de la octopina sintasa puede aumentar la expresión transitoria del gen NPTII en más de 20 veces. Además, las secuencias del extremo 3' de diferentes genes tienen diferentes eficiencias para promover la expresión génica. Por ejemplo, la secuencia terminal 3' de los glóbulos rojos promueve la expresión génica 60 veces más que la secuencia terminal 3' del gen de la chalcona sintasa.

2.2 Optimizar la secuencia alrededor del codón inicial

Aunque el codón de inicio es ubicuo en biología, los genes de diferentes fuentes biológicas tienen sus propias especialidades alrededor de la secuencia del codón de inicio. Por ejemplo, las características típicas de la secuencia que rodea el codón de inicio de la planta son AACCAUGC, la secuencia que rodea el codón de inicio del animal es CACCAUG y las secuencias que rodean el codón de inicio procariótico son muy diferentes de ellas.

Kosak estudió en detalle el impacto de las mutaciones dirigidas al sitio de las bases alrededor del codón de inicio ATG en la transcripción y la traducción, y concluyó que en eucariotas, la mayor eficiencia de transcripción y traducción se produce cuando la secuencia alrededor del codón de inicio es ACCATGG. la A en la posición -3 es muy importante para la eficiencia de la traducción. Esta secuencia se conoció más tarde como secuencia Kossack y se utilizó en la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, existe un gen de quitinasa bacteriana cuya secuencia codificante inicial es UUAUGG. Cuando se transformó en ACCAUGG, su expresión en el tabaco se multiplicó por ocho. Por lo tanto, cuando se construye un vector de expresión utilizando genes no vegetales, se debe modificar de acuerdo con las características de la secuencia que rodea el codón de inicio de la planta.

2.3 Región codificante del gen de transformación.

Si los genes extraños provienen de procariotas, los niveles de expresión de estos genes en las plantas suelen ser muy bajos debido a diferencias en los mecanismos de expresión. Por ejemplo, el gen de la proteína insecticida de tipo salvaje de Bacillus thuringiensis se expresó en niveles muy bajos en plantas, y se descubrió que esto se debía a diferencias en los genes procarióticos y vegetales, lo que resultaba en una estabilidad reducida del ARNm. Perlak y otros de la empresa Monsanto en Estados Unidos modificaron el gen de la proteína insecticida sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína venenosa. Seleccionaron codones preferidos por las plantas, aumentaron el contenido de GC y eliminaron la secuencia original que afectaba la estabilidad del ARNm. elementos. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de la proteína venenosa en las plantas transgénicas aumentó de 30 a 100 veces y se lograron efectos antiinsectos evidentes.

3 Elimina los efectos de posición

Cuando se transfieren genes extraños a plantas receptoras, sus niveles de expresión en diferentes plantas transgénicas suelen variar mucho. Esto se debe principalmente a los diferentes sitios de inserción de genes extraños en el genoma de las plantas receptoras. Éste es el llamado "efecto de posición". Para eliminar los efectos de posición e integrar todos los genes extraños en la región transcripcionalmente activa del genoma de la planta, las estrategias actuales de construcción de vectores de expresión generalmente consideran la aplicación de regiones de unión a la matriz nuclear y tecnología de integración dirigida al sitio.

La región de asociación matricial (MAR) es una secuencia de ADN que existe en la cromatina de las células eucariotas y se une específicamente a la matriz nuclear. Generalmente se cree que la secuencia MAR está ubicada en el límite de la estructura circular del ADN transcrito activamente y su función es crear un efecto de segmentación para que cada unidad de transcripción permanezca relativamente independiente y no se vea afectada por la cromatina circundante. Estudios relevantes han demostrado que colocar MAR en ambos lados del gen objetivo y construir un vector de expresión vegetal que contenga la estructura MAR-gen-MAR para la transformación genética puede mejorar significativamente el nivel de expresión del gen objetivo y reducir la diferencia en el nivel de expresión de El gen objetivo entre diferentes plantas transgénicas, reduce los efectos de posición. Por ejemplo, Allen et al. estudiaron los efectos de MAR heterólogo (de levadura) y MAR homólogo (de tabaco) sobre la expresión del gen Gus en el tabaco y descubrieron que el MAR de levadura puede aumentar el nivel de expresión del transgén en un promedio de 12 veces. mientras que el tabaco en sí MAR puede aumentar los niveles de expresión transgénica en un promedio de 60 veces. MAR derivado del gen de la lisozima del pollo también puede desempeñar el mismo papel.

Otro enfoque factible es utilizar tecnología de integración orientada al sitio. El principio fundamental de esta tecnología es que cuando el vector de transformación contiene un segmento de ADN homólogo al cromosoma del huésped, el gen extraño puede integrarse en un sitio específico del cromosoma mediante recombinación homóloga. En aplicaciones prácticas, primero se debe aislar el fragmento de ADN de la región transcripcionalmente activa del cromosoma y luego se debe construir el vector de expresión vegetal. En la manipulación genética de microorganismos, la integración dirigida al sitio de la recombinación homóloga se ha convertido en una tecnología de rutina. La integración dirigida al sitio de genes extraños ha tenido éxito en animales. Sin embargo, en plantas, a excepción de los vectores de expresión de cloroplastos, hay pocos informes de éxito. Transformación nuclear.

4. Construcción del vector de expresión del cloroplasto

Para superar los problemas de baja eficiencia de expresión de genes exógenos, efecto de posición e inseguridad causados ​​por la difusión de genes nucleares con el polen, en En los últimos años, ha habido una nueva tecnología de transformación genética, la transformación de cloroplastos, que ha sido cada vez más reconocida y valorada por sus ventajas y perspectivas de desarrollo. Hasta ahora, se ha logrado la transformación de cloroplastos en cinco plantas: tabaco, arroz, Arabidopsis, patata y colza (publicado por Hou Bingkai et al.), lo que convierte a esta tecnología de transformación en un nuevo punto de crecimiento en la ingeniería genética vegetal.

Actualmente se han determinado las secuencias completas de muchos genomas de cloroplastos vegetales, lo que sienta las bases para la integración específica de sitio de genes extraños en el genoma del cloroplasto mediante el mecanismo de recombinación homóloga. Los vectores de expresión de cloroplastos construidos hasta ahora son básicamente vectores de integración dirigidos al sitio. El vector de expresión de cloroplasto construido es básicamente un vector de caso de sitio fijo. Cuando se construye un vector de expresión de cloroplasto, normalmente se conecta una secuencia de ADN de cloroplasto, denominada fragmento de recombinación homóloga o fragmento de direccionamiento, a ambos lados del casete de expresión de gen exógeno. Cuando el vector se introduce en el cloroplasto, mediante recombinación homóloga entre estos dos fragmentos y el mismo fragmento en el genoma del cloroplasto, es posible integrar el gen extraño en un sitio específico del genoma del cloroplasto. En la transformación de cloroplastos para el mejoramiento de cultivos, se requiere que después de la recombinación homóloga, la inserción de genes extraños no cause la pérdida de la secuencia original del gen del cloroplasto, ni destruya la función del gen original en el punto de inserción. Para cumplir con este requisito, se seleccionaron dos genes adyacentes como fragmentos de recombinación homóloga, como rbcL/accD, 16 strnv/rpsl2rps7, psba/trnk, rps7/ndhb. Cuando ocurre la recombinación homóloga, el gen extraño se inserta en la región espaciadora de dos genes adyacentes en una ubicación específica, asegurando que la función del gen original no se vea afectada.

Recientemente, Daniel et al. construyeron un vector universal utilizando los genes del cloroplasto del tabaco trnA y trnI como fragmentos de recombinación homólogos. Dado que las secuencias de ADN de trnA y trnI están altamente conservadas en las plantas superiores, los autores creen que este vector puede usarse para la transformación de cloroplastos en muchas plantas diferentes. Si se confirma la versatilidad de este vector, este trabajo proporcionará sin duda una buena idea para construir un nuevo vector de expresión de cloroplastos conveniente y práctico.

Debido al alto número de copias del genoma del cloroplasto, los genes extraños que están integrados de manera específica en el genoma del cloroplasto a menudo se pueden expresar de manera eficiente. Por ejemplo, McBride et al. transfirieron el gen de la toxina Bt CryIA(c) a los cloroplastos del tabaco por primera vez. El nivel de expresión de la proteína de la toxina Bt alcanza entre el 3% y el 5% de la proteína total de la hoja, mientras que la proteína nuclear habitual. La tecnología de transformación sólo puede alcanzar entre el 0,001% y el 0,6%. Recientemente, Kota et al. transfirieron el gen de la proteína Bt Cry2Aa2 a los cloroplastos del tabaco y descubrieron que el nivel de expresión de proteínas tóxicas en las hojas de tabaco es muy alto, representando del 2% al 3% de las proteínas solubles, que es de 20 a 30 veces mayor que el gen de la proteína Bt Cry2Aa2 en los cloroplastos del tabaco. Transformación nuclear. El tabaco modificado genéticamente no sólo repele los insectos sensibles sino que también mata a los que son muy resistentes. Staub et al. informaron recientemente que el nivel de expresión del gen de la hormona del crecimiento humano transferido a los cloroplastos del tabaco llega al 7% de la proteína total de la hoja, que es 300 veces mayor que el de la transformación nuclear. Estos experimentos demuestran plenamente que la construcción y transformación de vectores de expresión de cloroplastos es una de las formas importantes de lograr la expresión eficiente de genes extraños.

Aplicación de señales de posicionamiento

El objetivo principal de estas estrategias de optimización de vectores es mejorar la eficiencia de transcripción y traducción de genes extraños. Sin embargo, si las proteínas extrañas expresadas en alto nivel pueden existir de manera estable en las células vegetales y en qué cantidad se acumulan es otra cuestión importante que debe considerarse en la transformación genética de las plantas.

En los últimos años, las investigaciones han descubierto que si ciertos genes exógenos se conectan a secuencias de señales de posicionamiento apropiadas para producirlos y transportarlos a partes específicas de la célula, como cloroplastos, retículo endoplásmico, vacuolas, etc., Se pueden lograr cambios significativos. Mejorar la estabilidad y acumulación de proteínas extrañas. Esto se debe a que ciertas regiones, como el retículo endoplásmico, proporcionan un entorno interno relativamente estable para algunas proteínas extrañas, lo que previene eficazmente la degradación de proteínas extrañas. Por ejemplo, Wong et al. vincularon la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad rbcS de Arabidopsis thaliana con genes de proteínas insecticidas y descubrieron que las proteínas insecticidas pueden acumularse específicamente en los cloroplastos del tabaco transgénico, y la acumulación total de proteínas extrañas es un 10% mayor que la de la subunidad rbcS de Arabidopsis thaliana. la del control. Recientemente, Song, et al. La secuencia peptídica de tránsito de la subunidad rbcS también se conectó a genes relacionados con la síntesis de PHB en un intento de acumular los productos de expresión génica en los plastidios de semillas de colza transgénicas, aumentando así el contenido de proteínas extrañas. Además, Vandelt et al. y Schouten et al. vincularon la secuencia de localización del retículo endoplásmico (secuencia codificante del tetrapéptido KDEL) al gen de la proteína extraña y descubrieron que el contenido de proteína extraña en plantas transgénicas aumentaba significativamente. Es obvio que las señales de localización promueven positivamente la acumulación de proteínas, pero es necesario determinar más a fondo si la misma señal de localización se aplica a todas las proteínas.

Aplicación del intrón 6 para mejorar la expresión genética

El efecto de los intrones para mejorar la expresión genética fue descubierto por primera vez por Callis et al. en el maíz transgénico, la alcohol deshidrogenasa de maíz. El primer intrón (intrón). 1) del gen (Adhl) mejora significativamente la expresión del gen extraño, y otros intrones del gen (como el intrón 8, el intrón 9) también mejoran en cierta medida la expresión de genes extraños. Posteriormente, Vasil et al. también descubrieron que el primer intrón del gen de la fructosa sintasa del maíz puede aumentar el nivel de expresión de CAT 10 veces. El tercer intrón del gen de actina del arroz también puede aumentar el nivel de expresión del gen indicador de 2 a 6 veces. Hasta ahora, el mecanismo por el cual los intrones mejoran la expresión génica no está claro, pero en general se cree que la presencia de intrones puede mejorar la eficiencia del procesamiento y la estabilidad del ARNm. Muchos estudios realizados por Tanaka et al. han demostrado que el efecto de mejora de los intrones sobre la expresión genética ocurre principalmente en monocotiledóneas pero no en dicotiledóneas.

Debido a que los intrones pueden mejorar la expresión génica, Mcelroy et al. mantuvieron deliberadamente el primer intrón del gen de actina de arroz aguas abajo del promotor del gen al construir un vector de expresión monocotiledónea. De manera similar, Christensen et al. colocaron el primer intrón del gen de la ubiquitina del maíz aguas abajo del promotor al construir un vector para mejorar la expresión de genes extraños en monocotiledóneas. Sin embargo, algunos estudios han señalado que el efecto de promoción de intrones específicos sobre la expresión génica depende de varios factores como la fuerza del promotor, el tipo de célula, la secuencia del gen diana y, a veces, incluso depende de la posición del intrón en el vector. Por ejemplo, el intrón 9 del gen Adhl del maíz se sitúa en el extremo 5' del gen Gus. Bajo el control del promotor CaMV35S, la expresión del gen Gus no aumenta. Cuando el intrón está situado en el extremo 3-terminal del gen Gus, el nivel de expresión del gen Gus aumenta aproximadamente 3 veces bajo el control del mismo promotor. Se puede observar que el mecanismo de los intrones en la expresión génica puede ser muy complejo. Todavía falta un modelo fijo sobre cómo utilizar los intrones para construir vectores de expresión vegetales eficientes, lo que merece una mayor exploración.

7 Estrategia Multigénica

Hasta ahora, la mayoría de los estudios de transformación genética implican la transferencia de un único gen extraño a la planta receptora. Sin embargo, a veces no se pueden obtener plantas transgénicas ideales debido a la falta de una intensidad de expresión genética única o de un mecanismo de acción único.

Si se transfieren dos o más genes sinérgicos a las plantas al mismo tiempo, se obtendrán mejores resultados que la transformación de un solo gen. Esta estrategia se ha utilizado para crear plantas genéticamente modificadas que sean resistentes a plagas y enfermedades. Por ejemplo, dependiendo del espectro de resistencia a los insectos y del mecanismo de acción de los genes resistentes a los insectos, se pueden seleccionar dos genes con funciones complementarias para la construcción del vector, y los dos genes resistentes a los insectos se pueden transferir simultáneamente a las plantas de una manera determinada. . Wang Wei y otros transformaron simultáneamente genes de lectina y genes inhibidores de proteasa en algodón y obtuvieron plantas transformadas que contenían genes bivalentes resistentes a insectos. Barton et al. transfirieron simultáneamente el gen de la proteína insecticida Bt y el gen de la toxina del escorpión al tabaco, mejorando en gran medida la resistencia de los insectos y evitando que las plagas desarrollaran resistencia (patente). En términos de resistencia a las enfermedades, Lan Haiyan y otros en nuestro laboratorio construyeron un vector de expresión vegetal bivalente que contenía el gen de la β-1,3-glucanasa y el gen de la quitinasa y lo introdujeron en la colza y el algodón. Los resultados mostraron que las plantas transgénicas tenían una evidente resistencia a las enfermedades. Recientemente, Feng Daorong, Li Baojian y otros conectaron dos o tres genes antifúngicos y el gen hpt a un vector, dos genes de resistencia a insectos y el gen bar a otro vector, y los introdujeron en plantas de arroz utilizando una pistola genética. Los resultados mostraron que el 70% de las plantas de progenie de arroz silvestre contenían todos los genes extraños introducidos (6 a 7), y los genes extraños introducidos tendían a integrarse en uno o dos sitios del genoma.

Por lo general, la transformación convencional no puede introducir fragmentos de ADN extraños de más de 25 kb en las células vegetales. Algunos genes funcionalmente relacionados, como los genes de rasgos cuantitativos y los genes de resistencia a enfermedades en las plantas, existen principalmente en forma de "grupos de genes". Si algunos fragmentos grandes de ADN de más de 100 kb, como grupos de genes naturales en los cromosomas de las plantas o una serie de genes extraños no relacionados, se introducen en el mismo sitio del genoma de la planta, es posible que múltiples genes controlen rasgos excelentes o produzcan una amplia variedad de genes. gama de Tiene una amplia gama de resistencia a insectos y enfermedades, y también brinda a las células receptoras una nueva vía metabólica para producir nuevas biomoléculas. Además, la inserción sincrónica de grandes genomas o grupos de genes también puede superar en cierta medida el efecto de posición causado por los transgenes y reducir la aparición de fenómenos indeseables como el silenciamiento de genes. Recientemente, Hamilton en Estados Unidos y Liu Yaoguang en China han desarrollado una nueva generación de sistemas vectoriales, concretamente BIBAC y TAC, que clonan grandes fragmentos de ADN y los transforman directamente en plantas con la ayuda de Agrobacterium. Estos dos vectores no sólo pueden acelerar la clonación basada en mapas genéticos, sino que también tienen un valor de aplicación potencial para la mejora de variedades bajo control de múltiples genes. En la actualidad, acaba de comenzar la investigación sobre la aplicación de los vectores BIBAC y TAC en la transformación multigénica.

8 Utilización y eliminación de genes marcadores de detección

La selección de genes marcadores se refiere a marcadores que permiten seleccionar células (o individuos) transformadas de muchas células no transformadas durante la transformación genética. Gene. Generalmente permiten que las células transgénicas produzcan productos que son resistentes a un determinado agente de selección, permitiendo que las células transgénicas crezcan normalmente en el medio que contiene este agente de selección, mientras que las células no transgénicas muestran resistencia a este agente de selección debido a la falta de resistencia. de sensibilidad, incapaz de crecer, desarrollarse y diferenciarse. Al construir el vector, el gen marcador de detección se conecta a un lado del gen objetivo y cada gen tiene su propia secuencia reguladora genética (como promotor, terminador, etc.). Actualmente, existen dos tipos principales de detección de uso común. genes marcadores: genes de enzimas de resistencia a antibióticos y genes de enzimas de resistencia a herbicidas. Los primeros pueden desarrollar resistencia a ciertos antibióticos y los segundos pueden desarrollar resistencia a los herbicidas. Los genes de enzimas de resistencia a los antibióticos más comúnmente utilizados son el gen NPTII (produce neomicina fosfotransferasa, resistencia a la kanamicina), el gen HPT (produce higromicina fosfotransferasa, resistencia a la higromicina) y el gen Gent (produce resistencia a la higromicina). Los genes de resistencia a herbicidas comúnmente utilizados incluyen el gen EPSP (produce 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, resistencia al glifosato), el gen GOX (produce glifosato oxidasa, degrada el glifosato) y el gen bar (produce PPT acetiltransferasa, resistente al bialafos o glufosinato). etc.

Vale la pena destacar los puntos 1, 2, 3, 5 y 6 anteriores, especialmente el 5, porque desea secretarlo fuera de la célula. El vector principal puede ser PB I121 y luego se puede cambiar el genotipo.

El siguiente paso es el de clonación, que es relativamente sencillo.

1 Primero obtenga el sitio de restricción del gen diana y conéctelo al vector modificado.

2. Transferir el plásmido a E. coli DH5a para su amplificación.

3. Transferir el plásmido amplificado a células vegetales para su expresión.

4. Recoger el medio de cultivo extracelular de las raíces para detectar la expresión y secreción de proteínas.

En cuanto a los pasos para transformar el vector, déjame explicarte brevemente para poder responder a la pregunta. Después de todo, si realmente construyes una buena compañía, puedes iniciar tu propia empresa.