Cómo realizar correctamente la medición ELISA
I. Recogida y conservación de muestras clínicas
El suero (plasma) es la muestra clínica más utilizada para la medición ELISA. En ocasiones se utilizan saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces y otras muestras. También se utiliza para fines de prueba específicos. Actualmente, los marcadores determinados clínicamente a partir de muestras de suero incluyen generalmente antígenos y anticuerpos de patógenos infecciosos, marcadores tumorales, hormonas, proteínas especiales, citocinas, fármacos terapéuticos, etc. Para la recolección de muestras de suero para medición de hormonas y fármacos terapéuticos, se debe tener en cuenta que el tiempo de recolección e incluso la posición del cuerpo pueden afectar los resultados de la medición. Por ejemplo, la cortisona tendrá un pico entre las 4 y las 6 a. m.: la hormona del crecimiento, la hormona luteinizante (LH) y la hormona folículo estimulante (FSH) se liberan en un patrón paroxístico. Por lo tanto, es necesario tomar varias muestras de sangre en intervalos de tiempo estrechamente relacionados y utilizar el valor medio como valor de medición. Por otro ejemplo, al cambiar de una posición acostada a una posición de pie, la actividad de la renina en el suero aumentará significativamente. Otro ejemplo es el ensayo de fármacos terapéuticos. El momento óptimo para el análisis de sangre debe seleccionarse en función de la farmacocinética. La recolección de muestras de suero para la detección de antígenos y anticuerpos, marcadores tumorales y proteínas especiales de patógenos infecciosos no tiene impacto en el tiempo y la postura, pero se deben considerar los siguientes aspectos durante el procesamiento y almacenamiento:
(1 ) Tenga cuidado para evitar una hemólisis grave. La hemoglobina contiene grupos hemo y tiene actividad similar a la del peróxido. Por lo tanto, en el ensayo ELISA que utiliza HRP como enzima marcadora, si la concentración de hemoglobina en la muestra de suero es alta, se adsorberá fácilmente en la fase sólida durante el proceso de incubación, reaccionando así con el sustrato de HRP agregado más tarde para desarrollar color. .
(2) Durante el proceso de recolección de muestras y separación de suero, se debe prestar atención a evitar la contaminación bacteriana tanto como sea posible. Debido al crecimiento de bacterias, algunas enzimas secretadas por ellas pueden descomponer proteínas como. antígenos y anticuerpos; en segundo lugar, algunas enzimas endógenas de bacterias, como la β-galactosidasa de Escherichia coli, pueden provocar interferencias no específicas en los correspondientes métodos de ensayo marcados con enzimas.
(3) Si la muestra de suero se separa mediante operación aséptica, se puede almacenar a 2 ~ 8 ℃ durante una semana. Si se separa mediante operación bacteriana, se recomienda congelarla. El almacenamiento prolongado de muestras debe ser inferior a -70°C.
(4) Tenga cuidado de evitar la congelación y descongelación repetidas de muestras de suero congeladas debido a cortes de energía. La fuerza de corte mecánica generada por la congelación y descongelación repetidas de las muestras destruirá moléculas como las proteínas de la muestra, lo que dará lugar a resultados falsos negativos. Además, preste atención a la mezcla de muestras congeladas y descongeladas, no agite violentamente y mezcle repetidamente.
(5) Si hay contaminación bacteriana que causa turbidez o flóculos durante el proceso de almacenamiento, el sobrenadante debe tomarse para analizarlo después de la centrifugación.
2. Preparación de los reactivos
En los laboratorios clínicos, la preparación de los reactivos generalmente no se toma en serio. La práctica habitual es sacar los reactivos del refrigerador y usarlos inmediatamente durante el experimento. Ignorar este enfoque puede afectar el problema de un tiempo de incubación insuficiente en el futuro. La consecuencia directa es que algunas muestras positivas débiles aparecerán como falsos negativos. Por lo tanto, en la preparación de reactivos ELISA, lo más importante es sacar el kit del refrigerador antes de comenzar el experimento, dejarlo a temperatura ambiente por más de 20 minutos y luego medir, para que el kit alcance el equilibrio con la temperatura ambiente. antes de su uso. El propósito de esto es principalmente hacer que la temperatura en el micropocillo de reacción alcance rápidamente la altura requerida en los pasos posteriores de la reacción de incubación para cumplir con los requisitos de medición. En segundo lugar, la solución de lavado de placas de los kits de inmunoensayo ligado a enzimas actualmente disponibles en el mercado debe diluirse y prepararse con el concentrado proporcionado cuando se utiliza en el laboratorio, por lo que se debe garantizar la calidad del agua destilada o desionizada utilizada para la dilución. Además, cuando se utiliza OPD como sustrato en el kit, la solución de sustrato debe prepararse temporalmente antes de que la reacción adquiera color.
En tercer lugar, agregue muestras de suero y reactivos de reacción.
En los kits ELISA comerciales actuales, agregar muestras de suero es casi el único paso para agregar muestras usando un micromuestreador. Los puntos clave a los que se debe prestar atención al utilizar el micromuestreador son: no agregar la muestra demasiado rápido, evitar agregar la muestra en la parte superior de la pared del pozo y evitar salpicar y generar burbujas. Es demasiado rápido y no puede garantizar la precisión y uniformidad de la microdosificación. Agregar al área superior sin recubrimiento de la pared del pozo puede causar fácilmente una adsorción no específica. Las salpicaduras pueden contaminar los agujeros adyacentes. Cuando aparecen burbujas, la interfaz del líquido de reacción es diferente. En los kits de prueba domésticos, los reactivos se gotean básicamente desde frascos goteros. Además del ángulo de caída, también es importante la velocidad de caída. Si la caída es demasiado rápida, es fácil repetir la caída o adición entre los dos pocillos, lo que provocará una adsorción no específica en las áreas no recubiertas de los pocillos, lo que dará como resultado un desarrollo de color no específico. Por lo tanto, a veces una muestra del mismo kit es positiva esta vez y negativa la siguiente. Esto suele deberse a los errores mencionados anteriormente al agregar muestras y reactivos.
Cuarto, educación cálida
La incubación es el factor más crítico que afecta el éxito o el fracaso de ELISA. ELISA es un método de inmunoensayo en fase sólida. La reacción de unión del antígeno y el anticuerpo se realiza en la fase sólida. Para que el antígeno o anticuerpo en la fase líquida se combine completamente con el anticuerpo o antígeno específico en la fase sólida, deben reaccionar a una determinada temperatura durante un tiempo determinado. El tiempo necesario para la incubación es inversamente proporcional a la temperatura, es decir, cuanto mayor es la temperatura, menor es el tiempo necesario.
Las temperaturas de incubación más utilizadas son 37°C y temperatura ambiente, seguidas de 43°C y 2 ~ 8°C.
La incubación es la forma más propensa a tener problemas en ELISA clínico. Por lo general, el tiempo de incubación de la reacción de los kits ELISA comerciales nacionales es de 30 minutos a 1 hora a 37 °C, mientras que el tiempo de incubación de la reacción de los kits ELISA importados suele ser de 1 a 2 horas a 37 °C, lo que puede afectar el límite inferior de determinación. Por lo tanto, en cuanto a la incubación, se debe prestar atención a los siguientes puntos en las operaciones de medición reales:
(1) Asegúrese de que haya suficiente tiempo de reacción a la temperatura establecida. En términos generales, después de agregar muestras y/o reactivos, al llevar la microplaca de temperatura ambiente a un baño de agua o incubadora, la temperatura en el pocillo tardará un cierto tiempo en subir de temperatura ambiente a 37 °C, especialmente si la temperatura ambiente es relativamente baja y la temperatura no es alta cuando está en estado de baño de agua. Sin embargo, en los laboratorios clínicos se ha prestado poca atención a esta cuestión. Por lo general, la microplaca se cronometra tan pronto como se coloca en la incubadora, lo que puede resultar fácilmente en un tiempo de incubación real medido. Un colega de un banco de sangre del sur planteó una vez una pregunta: siempre hay más de un mes de invierno al año. En el control de calidad interior para la determinación de HBsAg, la muestra positiva débil de 1 ng/ml proporcionada por el Centro de Laboratorio Clínico del Ministerio de Salud siempre fue indetectable. No sé por qué. Esto puede estar relacionado con la baja temperatura interior en el sur de mi país en invierno. En este momento, la microplaca se transfirió a la incubadora y el tiempo de incubación a 37°C no fue suficiente, por lo que las muestras positivas débiles fueron negativas. Por lo tanto, para garantizar un tiempo de incubación suficiente a 37 °C, el departamento de laboratorio puede determinar cuánto tiempo tarda la temperatura en los pocillos en alcanzar los 37 °C después de que la microplaca se lleva de la temperatura ambiente a la incubadora en diferentes estaciones (diferentes temperatura ambiente) en el laboratorio, extendiendo así adecuadamente el tiempo de colocación de las tiras en la incubadora. Específicamente, se coloca un pequeño termómetro en la solución de reacción en el pocillo de la placa para medición y observación.
(2) Selección de la temperatura del cultivo. En las instrucciones de algunos kits de ELISA se indica que existen dos temperaturas de incubación, como una a 37°C durante 1 hora y otra a 43°C durante 45 minutos. A juzgar por la naturaleza de la reacción antígeno-anticuerpo en los inmunoensayos, la reacción es más completa a temperaturas más bajas y durante mucho tiempo. Por ejemplo, 24 horas a 2-8 ℃. A temperaturas de reacción más altas, el tiempo de reacción se acorta debido al movimiento molecular. No hay problema en la determinación de muestras positivas fuertes con más contenido molecular, pero se pueden pasar por alto muestras positivas débiles con menos contenido molecular. Por lo tanto, recomendamos que, siempre que sea posible, se utilicen condiciones con temperaturas de incubación más bajas y tiempos de reacción más prolongados en los ensayos clínicos ELISA.
(3) Eliminar el "efecto borde". En el pasado, en los ensayos ELISA que utilizaban placas de 96 pocillos, a menudo se encontraba un "efecto de borde", es decir, los pocillos periféricos eran de color más oscuro que los pocillos centrales. La causa de este "efecto de borde" pueden ser diferencias en las propiedades superficiales o termodinámicas entre los pocillos periféricos y los pocillos centrales de una placa de 96 pocillos. Pero otros estudios han confirmado que los gradientes termodinámicos en la incubación pueden ser la causa fundamental. El poliestireno en sí es un mal conductor del calor. En los ensayos ELISA de rutina en el laboratorio, cuando la placa se coloca a temperatura ambiente (generalmente alrededor de 25 °C) en una incubadora a 37 °C y la placa también se calienta, puede haber un gradiente termodinámico entre los pocillos periféricos y el pocillo central. . Por lo tanto, cuando se utiliza un baño de agua o se agrega solución de reacción al pocillo de la placa, calentar la placa y la solución a la temperatura de incubación (como 37 °C) puede eliminar fácilmente el "efecto de borde" y mejorar la repetibilidad del ensayo.
En resumen, en la medición clínica de ELISA, para garantizar buenos resultados de medición, se pueden utilizar los siguientes métodos simples para garantizar las condiciones de incubación, es decir, intentar usar un baño de agua y hacer la microplaca. flote durante la incubación en el agua, o coloque la tela de esmeril empapada en agua en la caja húmeda de la lonchera grande y colóquela en la caja tibia ya que el fondo del orificio del listón está en contacto directo con el agua o la tela húmeda. , la temperatura a 37 ° C y la alta temperatura del baño de agua o caja húmeda. Bajo las condiciones, la temperatura de la solución de reacción puede cambiar rápidamente con el invernadero.
5. Lavar las placas
El inmunoensayo en fase sólida es una tecnología de inmunoensayo heterogéneo que requiere la incubación de antígenos o anticuerpos unidos específicamente a la fase sólida con la reacción mediante operaciones de lavado. -Los componentes específicos adsorbidos durante el proceso se separan para garantizar la especificidad del ELISA. Por lo tanto, el lavado de placas también es un paso extremadamente crítico en la determinación ELISA. La solución de lavado utilizada en los kits de ELISA con HRP como enzima marcada es generalmente PBS neutro que contiene Tween20 al 0,05%, un detergente no iónico que contiene grupos hidrófilos e hidrófobos. Su mecanismo de acción en el lavado es que su grupo hidrofóbico forma un enlace hidrofóbico con el grupo hidrofóbico de la proteína adsorbida pasivamente en la fase sólida de poliestireno mediante interacción hidrofóbica, debilitando así la adsorción de la proteína y la fase sólida. Al mismo tiempo, bajo la acción conjunta de grupos hidrófilos y moléculas de agua en la fase líquida, la proteína puede separarse de la fase sólida y pasar a la fase líquida, logrando así el propósito de eliminar adsorbentes no específicos. Sin embargo, dado que el recubrimiento de anticuerpos o antígenos normalmente se adsorbe pasivamente en la fase sólida mediante interacciones hidrófobas con la fase sólida en condiciones alcalinas, se debe prestar atención a la concentración del detergente no iónico. Si la concentración de Tween20 en la solución de lavado de placas es superior al 0,2%, desorberá el antígeno o anticuerpo recubierto en la fase sólida, afectando el límite inferior de detección.
En los laboratorios clínicos, generalmente existen dos formas de lavar las placas ELISA, a saber, manual y lavadoras de placas. El lavado manual de la placa significa que después de cada incubación de la reacción, la solución de reacción se succiona o se seca y luego los pocillos de la placa se llenan con la solución de lavado. Después de dejarla durante 2 a 3 minutos, la solución de lavado se succiona o se seca y luego. Secar con palmaditas sobre papel absorbente. Repita los pasos de lavado anteriores de 3 a 4 veces y finalmente séquelos con papel absorbente antes de continuar con el siguiente paso de medición.
Lavar la tabla con una lavadora significa cambiar la operación manual anterior para lavar la tabla con una lavadora. Una característica de usar una lavadora para lavar los platos es que no se pueden secar con palmaditas después de cada lavado, por lo que quedan muchos residuos líquidos. Las lavadoras con menos residuos líquidos requerirán menos ciclos para limpiar a fondo los paneles que aquellas con más residuos. ¿Cuántas veces debe utilizar el laboratorio la lavadora para cumplir con los requisitos? Se puede realizar el siguiente experimento simple: seleccione una tira recubierta de HBsAgELISA 4×8, agregue las mismas muestras positivas y negativas débiles cada 2×8 pocillos, agregue el conjugado enzimático según las instrucciones del kit y complete la incubación. Cuando lave los pocillos de la placa, lave la primera fila una vez, la segunda fila dos veces y la tercera fila tres veces; hasta que la octava fila se lave ocho veces, agregue sustrato para desarrollar y medir el color. Si se lava tres veces, el desarrollo del color no cambiará, es decir, la medición colorimétrica de los pocillos de la placa lavados tres veces es la misma que la absorbancia de los pocillos de la placa lavados cuatro y cinco veces, y los valores positivos/negativos permanecen en el valor máximo.
Sexto, desarrollo del color
En los kits ELISA actualmente disponibles comercialmente con HRP como enzima marcadora, si se utiliza TMB como sustrato, el sustrato proporcionado son dos botellas de líquidos de aplicación. A y B, si se utiliza OPD como matriz, el kit proporciona tabletas o polvo de OPD preparado antes de su uso. Generalmente, las condiciones de reacción de color de los kits disponibles comercialmente son 37 °C o temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. En teoría, la reacción catalizada por sustrato de HRP se puede completar en 30 minutos a 37 °C, aunque la mayoría de las reacciones catalíticas se pueden completar en los primeros 10 minutos. Por lo tanto, para desarrollar completamente el color de los pocillos de muestra débilmente positivos, se recomienda finalizar la medición colorimétrica de la reacción después de 25 a 30 minutos a 37°C.
Además, antes de añadir el sustrato para iniciar la reacción de color, lo mejor es comprobar la eficacia de la solución de sustrato, es decir, añadir una gota de solución A y solución B a un pocillo de placa limpio y vacío. o tubo eppendorf para observar si hay desarrollo de color, significa que el sustrato se ha deteriorado. Al utilizar OPD como sustrato, debe quedar incoloro después de la preparación; de lo contrario, no se puede utilizar. Al utilizar TMB como sustrato, no es necesario proteger de la luz todo el proceso de reacción del color, mientras que al utilizar OPD como sustrato, es necesario protegerlo de la luz. Para conocer las características de reacción del color y las precauciones de TMB y OPD, consulte los capítulos anteriores. Una vez completada la reacción de color, agregue ácido para finalizar la reacción. Después de agitar y mezclar, se puede realizar la siguiente medición colorimétrica o juicio visual.
7. Colorimetría
La determinación colorimétrica de ELISA se realiza con un lector de microplacas. Algunos compañeros pueden pensar que como se realiza mediante un lector de microplacas, en este momento se puede hacer cualquier cosa. En realidad no, porque los instrumentos de etiquetado de enzimas más avanzados tienen muchas funciones y, si se usan incorrectamente, se obtendrán resultados incomprensibles. Por ejemplo, después de una medición colorimétrica utilizando un lector de microplacas, los valores de absorbancia de muchos pocillos de medición negativos son negativos o la tasa de falsos positivos de la medición aumenta considerablemente. Esto se debe principalmente a una mala comprensión y uso del lector de microplacas. En cuanto a cómo comprender y utilizar correctamente el lector de microplacas, consulte los capítulos pertinentes a continuación. Aquí, solo enfatizamos los dos puntos siguientes:
Al medir (1) colorimetría, asegúrese de prestar atención a si la longitud de onda del lector de microplacas está ajustada correctamente o si el filtro utilizado es correcto. En algunos laboratorios clínicos, el inmunoensayo ligado a enzimas utiliza tanto el kit TMB como el kit OPD, y la longitud de onda colorimétrica del primero es de 450 nm y del segundo es de 492 nm, por lo que el filtro debe reemplazarse en cualquier momento según sea necesario. Por lo tanto, el problema del mal uso de los filtros ópticos puede ocurrir fácilmente.
(2) Problema de selección colorimétrica de longitud de onda única o longitud de onda dual. Los instrumentos de etiquetado de enzimas de rango medio y superior tienen básicamente funciones colorimétricas de longitud de onda única y de longitud de onda dual. La llamada medición colorimétrica de longitud de onda única generalmente se realiza en la longitud de onda con máxima absorción de color, como 450 nm o 492 nm. El lector de microplacas de doble color y longitud de onda mide una vez en una longitud de onda sensible, como 450 nm, y una longitud de onda no sensible. como 630 nm, con la onda sensible hacia arriba y hacia abajo. La absorbancia medida es la suma de la absorbancia del color específico desarrollado por la reacción enzimática medida por la muestra y la absorbancia causada por huellas dactilares, rayones, polvo y otra suciedad en la placa. pozos; medir a una longitud de onda no sensible significa cambiar la longitud de onda a un cierto valor. El valor de absorbancia del color específico desarrollado por la reacción enzimática de la muestra es cero, y la absorbancia medida en este momento es el valor de absorbancia de la suciedad. . Finalmente, el valor dado por el lector de microplacas es la diferencia entre el valor de absorbancia en la longitud de onda sensible y el valor de absorbancia en la longitud de onda no sensible. Por tanto, la determinación colorimétrica de doble longitud de onda tiene la ventaja de eliminar los efectos de absorción no específica, huellas dactilares, arañazos, polvo, etc. Para medir la absorbancia de un color específico de la propia placa de gotas y de la muestra en los pocillos de la placa, generalmente no es necesario instalar pocillos en blanco. Si todavía se establecen agujeros en blanco cuando se utiliza el método colorimétrico de longitud de onda dual, la absorbancia de los agujeros de medición mencionados anteriormente puede ser negativa. Debido a que existe un cierto grado de incertidumbre en la absorción no específica de un solo pocillo blanco en ELISA, es decir, se pueden obtener diferentes valores de absorbancia cada vez o al mismo tiempo, por lo que es mejor utilizar doble -método colorimétrico de longitud de onda para medición colorimétrica ELISA.
Ocho. Juicio de resultados
Según la forma de expresar los resultados de la medición, la medición clínica ELISA se puede dividir en medición cualitativa y medición cuantitativa. La calificación consiste simplemente en llegar a una conclusión de "sí" o "no" sobre si la muestra contiene el antígeno o anticuerpo a detectar, las cuales se expresan como "positivo" y "negativo" respectivamente. Los ensayos cualitativos visibles se utilizan a menudo para identificar antígenos o anticuerpos contra agentes infecciosos y determinar la presencia de infección por un patógeno específico. Un ensayo cuantitativo es una determinación cuantitativa de la cantidad de antígeno que se detectará en una muestra, expresada como un valor específico. La determinación cuantitativa se utiliza básicamente para la determinación de sustancias antigénicas no patógenas, como hormonas, citoquinas, marcadores tumorales, fármacos de molécula pequeña, etc.
Actualmente, la mayoría de los kits de ELISA utilizados clínicamente en China se utilizan para la determinación cualitativa de antígenos o anticuerpos de patógenos infecciosos, y algunos se utilizan para la determinación cuantitativa de αFP, hCG y citocinas. La determinación de "positivo" y "positivo" en el ensayo cualitativo ELISA se basa en el valor del ensayo positivo (valor crítico) determinado por el kit. El "valor" de una determinación cuantitativa se basa en una curva dosis-respuesta (también llamada curva estándar) obtenida midiendo simultáneamente las sustancias estándar del kit. El procesamiento de datos de los resultados cualitativos y cuantitativos de ELISA se analizará en capítulos específicos posteriores. Lo que solo quiero enfatizar aquí es que los resultados "negativos" y "positivos" de la prueba cualitativa ELISA solo pueden juzgarse en función del valor crítico medido por el propio kit. El suero de control de calidad de valor fijo positivo débil proporcionado por Clinical. No se puede utilizar el Centro de Pruebas del Ministerio de Salud. ¿Por qué enfatizar este punto? Esto se debe principalmente a que muchos laboratorios de base utilizan la absorbancia del suero de control de calidad de valor fijo débilmente positivo (también llamado "suero de valor crítico" en el pasado) suministrado por el centro ministerial para juzgar los resultados. se considera positivo; de lo contrario, se considera negativo. Considere el valor crítico del kit. Todavía hay algunos laboratorios que persisten en este enfoque equivocado. El establecimiento del valor crítico del kit se basa en una serie de experimentos científicos y estudios estadísticos (ver más abajo). El suero de control de calidad de valor fijo positivo débil proporcionado por el centro ministerial se utiliza principalmente para el control de calidad en interiores en laboratorios clínicos.
A continuación, explicaremos algunas abreviaturas comúnmente utilizadas para determinar los resultados cualitativos de ELISA.
(1)S/CO: donde S es la abreviatura de muestra o espécimen, que indica el valor de absorbancia determinado por la muestra, y CO es la abreviatura del valor de corte. Excepto en el método de inhibición competitiva, en otros modos de medición cualitativa ELISA, cuando el valor S/CO es mayor o igual a 1, la muestra es positiva, y cuando es menor a 1, la muestra es negativa.
(2)S/N o P/N: S es lo mismo que (1), N es la abreviatura del control negativo y P es la abreviatura del paciente. Muchos de los primeros kits utilizaban S/N o P/N ≥ 2,1 como estándar positivo, y algunos kits todavía utilizan este método en la actualidad. Este método no es esencialmente diferente del método S/CO, excepto que el primero utiliza 2,1 veces el control negativo (n) como valor crítico.
Nueve. Informes e interpretación de resultados
Informar los resultados clínicos de ELISA es relativamente sencillo. Los ensayos cualitativos pueden ser negativos o positivos; los ensayos cuantitativos informan valores específicos. La interpretación de los resultados es mucho más compleja y requiere que los técnicos de laboratorio tengan una base de conocimientos exhaustiva de lo que se está midiendo. Por ejemplo, la interpretación de los resultados "dos y medio" de la hepatitis B no sólo requiere que el examinador conozca el significado clínico de los diferentes patrones de resultados, sino que también requiere una comprensión más profunda de la biología molecular, la variación molecular y su impacto en el fenotipo. del virus de la hepatitis B. En la actualidad, las pruebas ya no son una simple medición de laboratorio, sino que se han convertido en una disciplina médica clínica, es decir, medicina de laboratorio. Esto requiere que los médicos de laboratorio que realizan pruebas médicas no solo sepan lo que están haciendo, sino también por qué lo hacen. , de lo contrario será inevitablemente eliminado por los tiempos.
En resumen, aunque los pasos de operación de la medición ELISA son muy simples, hay muchos factores que pueden afectar los resultados de la medición, que se distribuyen en varios pasos de la operación de medición, especialmente la adición de muestras, la incubación y lavado de platos. Para ayudarle a analizar y encontrar posibles causas de problemas en su ensayo, la siguiente tabla resume los problemas comunes y sus causas.
Posibles problemas y motivos en la medición clínica ELISA
Hacer preguntas
Posibles motivos (no causados por el kit en sí)
1. No se pueden detectar muestras de control positivo débiles.
El tiempo de incubación o la temperatura no son suficientes; el tiempo de reacción de desarrollo del color es demasiado corto; hay algún problema con el agua destilada utilizada para preparar el tampón.
2. La repetibilidad de la medición es pobre.
(Dos resultados de medición de la misma muestra son inconsistentes)
Este es un problema típico causado por operaciones de medición, que incluyen
(1) Adición de muestra y prueba dosis incorrecta; inconsistente entre los pocillos;
(2) Agregue la muestra demasiado rápido, se produce contaminación entre los pocillos;
(3) Agregue la muestra incorrecta;
(4 ) Al agregar muestras y reactivos, agréguelos al área sin recubrimiento en la parte superior de la pared del pozo;
(5) Mezcle los componentes en kits con diferentes números de lote;
( 6) El tiempo de incubación, el lavado de la placa y el tiempo de desarrollo del color son inconsistentes;
(7) Restos contaminados en los pocillos;
(8) El filtro del lector de microplacas es incorrecto;
(9) Si la muestra de suero se añade antes de la coagulación completa, pueden aparecer coágulos de fibrina o células sanguíneas residuales en el pocillo de reacción, lo que puede dar lugar a reacciones falsas positivas.
3. Pizarra de escritura blanca
(El control positivo no desarrolla color)
(1) Falta conjugado enzimático;
(2 ) Hay un problema con la preparación de la solución de lavado, como que la probeta medidora no está limpia y contiene inhibidores enzimáticos (como la azida sódica).
(3) Omitir el desarrollador A o B;
(4) Se utiliza Terminator como desarrollador.
4. Todos los agujeros de la placa están coloreados.
(1) La placa de lavado no está limpia
(2) La solución de color se deteriora
(3) La absorción del sustrato agregado está contaminada; por la enzima;
(4) El líquido de lavado está contaminado por la enzima.