Red de Respuestas Legales - Derecho de patentes - Cómo analizar cuantitativamente los cambios en los niveles de modificación química en proteínas

Cómo analizar cuantitativamente los cambios en los niveles de modificación química en proteínas

La modificación por fosforilación es una modificación química importante de las proteínas, que juega un papel importante para completar o cambiar la función de las proteínas. Hay muchas dificultades técnicas en este campo, que plantean desafíos para este campo. En los últimos años, se han logrado muchos avances en tecnologías relacionadas y se han logrado muchos resultados nuevos en la investigación de la fosforilación. Este artículo presentará la detección de proteínas fosforiladas, el enriquecimiento de proteínas y péptidos fosforilados, mejoras en la tecnología de espectrometría de masas biológica, cuantificación y comparación de proteínas y péptidos fosforilados. Análisis cuantitativo de espectrometría de masas biológicas de proteínas fosforiladas y péptidos fosforilados Las actividades vitales están estrechamente relacionadas con los cambios dinámicos en las proteínas. En muchos casos, la cantidad absoluta de determinadas proteínas no cambia significativamente, sino que se logra o modifica mediante diversas modificaciones postraduccionales.

La modificación por fosforilación es una importante modificación química de las proteínas, que juega un papel importante a la hora de completar o cambiar la función de las proteínas. Hay muchas dificultades técnicas en este campo, que plantean desafíos para este campo. En los últimos años, se han logrado muchos avances en tecnologías relacionadas y se han logrado muchos resultados nuevos en la investigación de la fosforilación. Este artículo presentará la detección de proteínas fosforiladas, el enriquecimiento de proteínas y péptidos fosforilados, mejoras en la tecnología de espectrometría de masas biológica, cuantificación y comparación de proteínas y péptidos fosforilados. Análisis cuantitativo de espectrometría de masas biológicas de proteínas fosforiladas y péptidos fosforilados Las actividades vitales están estrechamente relacionadas con los cambios dinámicos en las proteínas. En muchos casos, las cantidades absolutas de determinadas proteínas no cambian significativamente, pero su función se cumple o se altera mediante diversas modificaciones postraduccionales. Entre la gran cantidad de modificaciones postraduccionales de proteínas, la fosforilación es una muy importante. Más del 30% de todas las proteínas descubiertas hoy pueden fosforilarse. La modificación por fosforilación de proteínas está estrechamente relacionada con muchos procesos biológicos, como la reparación de daños en el ADN [1], la regulación transcripcional [2], la transducción de señales [3] y la regulación de la apoptosis [4]. La investigación sobre proteínas y péptidos fosforilados nos ayuda a dilucidar el mecanismo del proceso anterior y comprender mejor la naturaleza de las actividades vitales. En los últimos años, han surgido muchas tecnologías y métodos nuevos relacionados, lo que ha promovido el progreso de la investigación en este campo. 1. Detección de proteínas fosforiladas. La mayor parte de la investigación actual sobre proteínas se basa en la electroforesis, y la detección de manchas de proteínas fosforiladas en geles es un vínculo importante. En las primeras investigaciones, el método más utilizado era metabolizar el fosfato marcado con 32P en las células y utilizarlo, de modo que las proteínas fosforiladas en las células tengan radiactividad 32P, que puede detectarse después de la electroforesis [5]. Este método requiere la exposición a grandes cantidades de material radiactivo y sólo puede aplicarse a células cultivadas, por lo que se ha ido eliminando gradualmente. La detección por transferencia Western de anticuerpos contra proteínas fosforiladas tiene las ventajas de una buena especificidad y alta resolución, y sigue siendo un método comúnmente utilizado [6]. Sin embargo, dado que no se puede utilizar el mismo gel para el análisis y la preparación, a veces es difícil hacer coincidir las manchas de proteínas detectadas con las del gel, lo que dificulta el análisis. Schulenberg et al. [7] informaron en 2003 sobre un tinte fluorescente de molécula pequeña, el tinte Pro-Q Diamond, que puede teñir específicamente proteínas fosforiladas. Este método es conveniente, rápido, altamente sensible, compatible con la identificación por espectrometría de masas y puede usarse para otros métodos de tinción. Martin et al. [8] dispusieron algunos fragmentos de proteínas y péptidos en varios sustratos comerciales y luego utilizaron el tinte de diamante Pro-Q para detectar los niveles de fosforilación de proteínas y péptidos en el chip, con una sensibilidad de 365, 438+02-625. fg. Esta combinación de micromatrices y métodos de detección altamente sensibles proporciona una plataforma poderosa para estudiar vías de señalización e inhibidores de fosfatasa. La electroforesis en gel de diferencia bidimensional fluorescente (2D-DIGE) es una tecnología que compara diferencias en proteínas marcadas fluorescentemente basándose en electroforesis bidimensional y tiene muy buena sensibilidad de detección. Y debido a que las proteínas objetivo que se van a comparar siempre se someten a electroforesis unidimensional y bidimensional en las mismas condiciones y se muestran en el mismo gel, la diferencia causada por errores experimentales se reduce, lo que convierte a esta tecnología en una poderosa herramienta para la investigación comparativa del proteoma. Las proteínas fosforiladas son sólo una pequeña parte de un determinado grupo de proteínas y la tecnología DIGE no puede etiquetarlas específicamente. Por lo tanto, es difícil realizar análisis comparativos de proteínas fosforiladas utilizando la tecnología DIGE. Seisuke et al. [9] resolvieron bien este problema. En sus experimentos, utilizaron un kit de enriquecimiento de proteínas fosforiladas para enriquecer las proteínas fosforiladas y luego utilizaron la tecnología DIGE para analizar las diferencias, ampliando el alcance de aplicación de la tecnología DIGE. 2. Enriquecimiento de proteínas y péptidos fosforilados Dado que el número de péptidos fosforilados es muy pequeño en comparación con los péptidos no fosforilados, otros péptidos los cubren fácilmente durante la identificación por espectrometría de masas. Por lo tanto, a menudo es necesario realizar proteínas o péptidos fosforilados. La identificación sólo puede realizarse después del enriquecimiento. Los métodos clásicos para enriquecer proteínas y péptidos fosforilados incluyen cromatografía de afinidad de iones metálicos (IMAC) [10], enriquecimiento con biotina-avidina [11], inmunoprecipitación [12] y análisis de capas de afinidad de fosfoanticuerpos [13]. La mayoría de los métodos anteriores se basan en la tecnología de cromatografía y el rendimiento del relleno de la columna cromatográfica es un factor clave que afecta el efecto de enriquecimiento. En 2004, Pinkse et al. [14] fabricaron una columna cromatográfica de fabricación propia utilizando empaquetamiento de TiO2_2 y luego utilizaron esta columna para separar los productos de la proteína fosforilada PKG. Después del análisis ESI-MS/MS en línea, se identificó que PKG tiene al menos ocho sitios de fosforilación, y también se descubrieron dos nuevos sitios de fosforilación, Ser-26 y Ser-44. Pinkse et al. creen que el relleno de TiO2 puede unirse a péptidos fosforilados de manera eficiente y específica, enriqueciendo así de manera efectiva los péptidos fosforilados, y tiene buenas perspectivas de aplicación.

El uso de una columna de fase inversa para desalar e identificar péptidos mediante espectrometría de masas después de la concentración es un método común, pero no es eficaz para identificar péptidos hidrófilos, como los péptidos fosforilados que se vuelven hidrófilos después de la fosforilación. Larsen et al. [15] compararon los efectos de separación de columnas rellenas de resina de fase inversa y grafito sobre péptidos fosforilados y creyeron que estas últimas pueden retener eficazmente los péptidos fosforilados y son más adecuadas para el enriquecimiento, la separación y la identificación de péptidos fosforilados. Para el enriquecimiento de péptidos fosforilados, algunos estudiosos no sólo se han centrado en la mejora de los rellenos de afinidad. Steven et al. [16] encontraron que la mayoría de los péptidos digeridos por tripsina tienen dos cargas positivas a alrededor de pH 2,7, y un péptido lleva una carga positiva después de la fosforilación. Basándose en este fenómeno, los péptidos fosforilados con carga positiva pueden enriquecerse mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte. Steven et al. utilizaron este método para identificar 2.002 sitios de fosforilación entre 967 proteínas en el núcleo de las células HeLa, obteniendo el mayor espectro de proteínas fosforiladas hasta la fecha. 3 Confirme el sitio de fosforilación mediante espectrometría de masas biológica. Los sitios de fosforilación se pueden determinar mediante espectrometría de masas primaria combinada con espectrometría de masas en tándem. Por ejemplo, la espectrometría de masas primaria MALDI-TOF/TOF puede encontrar picos espectrales de masas que difieren del valor teórico del peso molecular del péptido en 80 Da (HPO3=80 Da). En el espectro de masas secundario de este pico, si el ion precursor es de 98 Da (pérdida neutra H3PO4 = 98 Da), se puede determinar que el péptido es un péptido fosforilado (Figura 1) y se somete además a espectrometría de masas secundaria o multinivel. . Además, los residuos fosforilados de serina y treonina se convierten en aminoetilalanina, que es un isómero de lisina, mediante una reacción de eliminación β. Este sitio puede ser reconocido y digerido específicamente por tripsina, endopeptidasa Lys-C y otras enzimas, y el sitio de fosforilación puede determinarse fácilmente mediante espectrometría de masas. Por lo tanto, la confirmación de los sitios de fosforilación se basa en la aplicación de espectrometría de masas simplificada y espectrometría de masas en tándem y la mejora de la sensibilidad de detección de la espectrometría de masas. En los últimos años, el desarrollo de la tecnología de espectrometría de masas biológicas ha proporcionado más instrumentos y métodos opcionales para la detección de sitios de fosforilación de proteínas. 3.1 Espectrometría de masas por resonancia ciclotrón por transformada de Fourier (FT-ICRMS) La T-ICRMS es la espectrometría de masas más precisa hasta el momento, con una resolución de 1~2 ppm o mejor, lo que la hace adecuada para el análisis de sitios de fosforilación. La disociación por captura de iones (ECD) es una técnica aplicada a la espectrometría de masas ICR por transformada de Fourier y es un complemento a la espectrometría de masas en tándem tradicional. Los enlaces disulfuro se pueden abrir fácilmente, pero los frágiles enlaces de valencia de las modificaciones postraduccionales se pueden conservar cuando el ECD rompe la cadena peptídica, lo que hace que este método sea adecuado para el estudio de modificaciones postraduccionales. Figura 1 Identificación del péptido A fosforilado: espectro de masas primario de productos de digestión enzimática mediante espectroscopia MALDI-TOF/TOF. El pico espectral de masas del péptido fosforilado está marcado con un asterisco y tiene un peso molecular teórico de 80 Da (HPO3 = 80 Da) en relación con el péptido no fosforilado. b: En el análisis de espectrometría de masas secundaria del pico del espectro de masas marcado con un asterisco en a, se puede ver un pico faltante neutro 98 Da más pequeño que el ion original (H3PO4 = 98 Da).

específico/qwtz/show-133 .html