Biblioteca de dos híbridos de levadura: construcción y cribado de Baoji Biotechnology
Tenemos 13 años de experiencia en la construcción de bibliotecas y hemos completado la construcción de miles de bibliotecas. La tecnología y los kits utilizados son reactivos de construcción de bibliotecas de la más alta calidad del mercado, lo que garantiza que los indicadores de cada biblioteca construida cumplan con los estándares más altos del mercado. Nuestra tasa de éxito en la construcción de bibliotecas supera el 98 %. En cuanto a nuestros productos de construcción de bibliotecas, prometemos los siguientes indicadores, que son los más altos entre las empresas nacionales.
Shanghai Baoji combina muchos años de experiencia en construcción de bibliotecas para promover vigorosamente la tecnología de construcción de bibliotecas de "operación directa completa". En comparación con otros métodos de construcción (principalmente el método SAMRT de Takara y el método Gateway de Invitrogen), nuestros productos tienen grandes ventajas en tecnología y calidad.
Acerca de nuestros productos de construcción de bibliotecas, prometemos los siguientes indicadores, que son los más altos entre las empresas nacionales:
La capacidad original de la biblioteca es superior a 1 * 10 7 ufc
El fragmento insertado promedio es superior a 1200 BP;
La tasa de clonación positiva es superior al 95 %.
? 1. Utilizamos recombinación homóloga para construir la biblioteca, que no requiere ningún proceso de ligadura y escisión con endonucleasa para garantizar que la endonucleasa no corte el gen y garantizar la integridad del gen, mientras que Clonetech se construye mediante ligadura con endonucleasa. .
? 2. Debido a que recombinamos el ADNc en el vector mediante recombinación, que es mucho más eficiente que el método de tecnología de clonación de la ligasa SMART T4, prometemos que la capacidad de la biblioteca original será superior a 1 * 10 7. Además, la tasa de falsos positivos de recombinación es muy baja. Algunos de nuestros clientes aquí han probado 30.000 clones a la vez sin cargas vacías. Prometemos que la tasa positiva es superior al 98%, lo que es muy incomparable con el método de ligadura de digestión enzimática.
? 3.El método SMART de Clonetech utiliza PCR para sintetizar la segunda hebra. Debido a la supresión selectiva y la amplificación competitiva de la PCR, la redundancia de genes es muy alta. Los genes de baja abundancia no pueden amplificarse mediante la PCR, por lo que también se perderán los genes de segmentos largos y habrá muchas secuencias repetidas. Especialmente cuando la cantidad de muestra de ARN inicial es pequeña (por ejemplo, con 5 ug de ARN, se requieren más de 15 ciclos de amplificación por PCR, lo que reduce en gran medida la calidad de la biblioteca), el número de genes incluidos en la biblioteca se reduce considerablemente. Nuestro método de síntesis de ADNc utiliza una variedad de enzimas para sintetizar directamente la segunda cadena a una temperatura constante de 16 grados. Es completamente fiel a la situación genética de la muestra misma y no cambiará artificialmente la situación genética ni el tamaño del gen en la muestra.
4. Utilizamos transcriptasa inversa de alta calidad, reconocida como la mejor transcriptasa inversa. En comparación con la transcriptasa inversa de clonetech, tiene una temperatura de transcripción inversa más alta (inversión de 55 grados Celsius, la transcriptasa inversa de clonetech usa una inversión de 42 grados, una temperatura más alta puede abrir la estructura secundaria del ARN y obtener un ADNc más largo), la eficiencia de la transcripción inversa y la longitud del ADNc son mucho más altas. mejor. Prometemos que el fragmento de inserción promedio de la biblioteca es de más de 1,3 KBP y la longitud mínima es de más de 1 Kbp, mientras que las bibliotecas construidas con el método SMART de clonetech generalmente tienen solo unos pocos cientos de BP.
Proceso de construcción de biblioteca:
1. Extracción de ARN
2. Extracción de ARNm
3.3. p>
4.Adaptador de ADNc
5.El ADNc está separado por longitud.
6.6. Recombinación directa completa de ADNc y vector de biblioteca de dos híbridos de levadura (pGADT7 o pDEST22).
7. Electroconversión de productos recombinantes
8. Detección de bibliotecas y extracción de plásmidos
3.1 Comparación y ventajas del método directo total y el método SMART
3.2? Comparativa y ventajas del método directo y método de entrada
En el plazo de 25 días hábiles, si es necesario transformar la levadura, se ampliará por 15 días hábiles.
Observaciones: 1: Esta biblioteca de levadura puede agregar un paso de homogeneización. Podemos utilizar el método de homogeneización de DSN para construir una biblioteca híbrida de levadura homogeneizada de alta calidad, lo que reduce en gran medida la carga de trabajo y la eficiencia de la detección de la levadura posterior.
Los clientes pueden construir bibliotecas de ADNc de dos híbridos de levadura designadas. Los clientes pueden proporcionarnos tejidos, células o ARN total:
Muestras de células: el número de células es superior a 1 * 10. 7.
Muestra animal: más de 1 gramo
Muestra vegetal: más de 2 g
ARN total: más de 200 microgramos
Actualmente, Hemos completado con éxito miles de compilaciones de bibliotecas sin muestras. Los principales clientes son la Academia de Ciencias de China, el Instituto de Fisiología y Ecología Vegetal de Shanghai, la Universidad Jiao Tong de Shanghai, la Universidad de Zhejiang, la Academia de Ciencias Agrícolas de Zhejiang, la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong y otras unidades que han completado la construcción de levaduras bihíbridas. bibliotecas. Las especies incluyen humanos, ratones, ratas, arroz, Arabidopsis, peonías, saltamontes del arroz, manzanas, colza, trigo, conchas, uvas, hongos, etc.
Somos una de las pocas empresas en China que puede proporcionar tanto construcción como inspección de bibliotecas. Para los servicios de detección de dos híbridos de levadura, solo necesita proporcionar la secuencia del gen del cebo. Haremos el siguiente trabajo y seleccionaremos el precio a 30.000 RMB.
1. Verificación de secuenciación del vector cebo y construcción de un vector de cribado bihíbrido.
2. Detección por autoactivación de genes de cebo. Si la prueba está calificada, continúe con el siguiente experimento.
3. Transforme las células de levadura con el plásmido cebo y luego transforme el plásmido de la biblioteca después de la verificación.
4. Detección de levaduras y optimización de las condiciones 3AT
5. Clasificación de los resultados de la detección
6. 7. Enviar los resultados de la detección: incluido el informe de la detección, los resultados de la secuenciación y los resultados de la explosión de los resultados de la detección, y los plásmidos clonados a partir de los resultados de la detección.
9.1. ¿Cómo elegir el método de construcción de base de datos adecuado para construir una base de datos?
Somos la única empresa en el mercado que puede proporcionar tres métodos de construcción de bases de datos al mismo tiempo, lo que es suficiente para ilustrar la fortaleza técnica de nuestra empresa. ※.
※La comparación de los tres métodos es la siguiente:
? 1) El método inteligente de Clonetech básicamente se elimina. Tenemos una comparación técnica detallada arriba. Su única ventaja es que la cantidad inicial de ARN puede ser muy pequeña, generalmente sólo unos pocos ug. Este método tiene un costo muy bajo y generalmente no se recomienda.
? 2) La calidad del método de Invitrogen es mucho mejor que la de SMART. Requiere reactivos de muy alta calidad y se deben utilizar todos los reactivos originales de Invitrogen. Todos utilizamos reactivos de Invitrogen para construir bibliotecas y realizar algunas mejoras técnicas para mejorar la calidad de la biblioteca. Este método requiere un ARN inicial más alto y la dosis inicial recomendada es más de 200 ug. Sin embargo, este método tiene un serio inconveniente, es decir, requiere dos recombinaciones para obtener una biblioteca de levadura. Una recombinación más conducirá a un proceso de amplificación de la biblioteca más, lo que afectará seriamente la calidad de la biblioteca. Hay una comparación técnica detallada y una introducción arriba.
? Otras empresas que utilizan este método para crear bibliotecas solo pueden utilizar suites comerciales para crear bibliotecas sin ninguna mejora. Y debido a los canales de compra, no pueden comprar algunos reactivos del kit y la calidad se reducirá considerablemente. Por ejemplo, al utilizar DH10B para transformar células competentes, la eficiencia de transformación de este tipo de células competentes es más de 100 veces mayor que la de las células producidas en el país. Una batería de esta capacidad requiere mucha aprobación aduanera para su compra, y otras empresas no pueden importarla porque no tienen las calificaciones pertinentes.
? 3) El método patentado directo completo, que es nuestro método patentado exclusivo, es una mejora importante con respecto al método invitrogen. Conserva sus ventajas (sin necesidad de amplificación por PCR, alta fidelidad de la biblioteca) y elimina la desventaja de requerir dos recombinaciones, lo que mejora enormemente. la calidad de la biblioteca. En comparación con el método Invitrogen, la longitud promedio se puede aumentar en 200 pb y la capacidad de la biblioteca se puede aumentar en más de 10 veces. Este método requiere la misma cantidad de ARN que el método Invitrogen.
9.2. ¿Cuáles son los contenidos del producto de la biblioteca de papel dual de levadura proporcionada por Baoji Biotechnology?
※Los productos de biblioteca que ofrecemos incluyen calidad de biblioteca (más de 200 ug) y bacterias de glicerol en bibliotecas de E. coli. Al mismo tiempo, tenemos la opción de proporcionar una biblioteca de bacterias de glicerol transformadas en células de levadura. Proporcionaremos 100 bibliotecas de bacterias de glicerol transformadas en células de levadura y podremos realizar 100 evaluaciones de bibliotecas.
Los plásmidos de la biblioteca se pueden seleccionar mediante el método de transformación * *, y las bacterias de glicerol de la biblioteca de células de levadura se pueden seleccionar mediante el método de maiting. Se pueden seleccionar libremente según los hábitos experimentales del profesor. , y no habrá diferencia en los resultados. ※.
9.3. ¿Cómo comprobar la calidad de las bibliotecas?
Un estándar de oro simple para la calidad de la biblioteca es que todos los genes de la muestra estén en la biblioteca. Si más de la mitad de los genes de longitud completa están presentes, la biblioteca está calificada. ※.
Para las pruebas de biblioteca, podemos realizar las siguientes pruebas en los productos que entregamos. ※:
De acuerdo con la información de muestra del maestro, seleccione de 3 a 5 genes de baja copia, diseñe cebadores sintéticos y use el plásmido de biblioteca que proporcionamos como plantilla para realizar la amplificación por PCR. Si se pueden amplificar ambos genes de baja copia, los genes de alta copia no se perderán y se puede considerar que la calidad de la biblioteca es calificada.
Para las bacterias de glicerol en la biblioteca de E. coli que proporcionamos, puede usar una dilución en gradiente para el cultivo en placa, calcular la capacidad de la biblioteca al día siguiente y seleccionar clones individuales para la amplificación por PCR y la secuenciación para determinar la integridad. del fragmento insertado. ※.
9.4. ¿Cómo evaluar la calidad de las bibliotecas?
Los indicadores clave de la calidad de la biblioteca son la capacidad de la biblioteca, la tasa de nulos y la longitud media de las inserciones. ※.
La capacidad de almacenamiento original de la biblioteca debe ser lo más alta posible. Nuestra empresa promete una capacidad de almacenamiento superior a 1 * 10 7, que es la capacidad de almacenamiento original, es decir, la capacidad de almacenamiento convertida directamente sin ningún proceso de amplificación. ※ En comparación con la capacidad de biblioteca de 1 * 10 6 prometida por otras empresas, es más de 10 veces mayor. A continuación se detalla el impacto de la capacidad de la biblioteca en la calidad de la biblioteca:
A excepción de los organismos inferiores, el número de genes en las muestras biológicas es aproximadamente 5 * 10 4, y la biblioteca debe cubrirse al menos 100 veces, es decir es decir, la capacidad de almacenamiento es al menos Para alcanzar 5 * 10 6. ※.
Para las muestras de plantas, la cantidad de genes es mucho mayor que la de los humanos. Por ejemplo, las muestras de arroz son 2-3 veces mayores que las de los humanos y las muestras de trigo son 5-6 veces mayores que las de los humanos. , por lo que se necesita más capacidad de biblioteca. ※.Para muestras de arroz, la cantidad de genes debe cubrirse 100 veces y la capacidad de la biblioteca original requerida es mayor que 1 * 10 7. Las bibliotecas proporcionadas por otras empresas del mercado sólo pueden cubrir unas 10 veces como máximo. Una cobertura tan baja conducirá inevitablemente a la pérdida de una gran cantidad de genes.
Para algunas empresas, cuanto mayor sea la capacidad de la biblioteca, mejor. Esto es absolutamente irresponsable y crea excusas irrazonables para una calidad deficiente de la biblioteca. ※.
En cuanto a la longitud del gen insertado, la longitud promedio de otras empresas es de alrededor de 800 pb, pero nuestra empresa puede prometer alcanzar más de 1200 pb. El impacto de la longitud del encarte en la calidad de la biblioteca se describirá en detalle aquí. ※:
Por lo general, la longitud de los genes funcionales superará los 200 aminoácidos, es decir, la región codificante superará los 600 pb. Además de la región codificante, también existen la región 5'UTR, la región 3'UTR y la región poliA. En general, el gen tiene al menos 1000 pb de longitud. ※.Debido a que la biblioteca es una mezcla, habrá inhibición competitiva. Demasiados genes cortos afectarán inevitablemente la proporción de genes largos y la abundancia de expresión de genes largos.
La longitud media de las inserciones de nuestros productos de biblioteca será de más de 1200 pb, y la más corta rondará los 1000 pb. ※.Para la selección de bibliotecas, no significa que solo se necesite un fragmento de gen. La función de las proteínas requiere la participación de muchos factores. Si el gen insertado es demasiado corto, el resultado de la prueba será sólo un fragmento de gen, o incluso un gen corto cerca de poliA. ¿Qué tan factible es este resultado? Básicamente se puede considerar un resultado falso positivo.
※Para algunas empresas, afirmar que la longitud del inserto genético en la biblioteca no es más larga es en realidad un engaño extremadamente irresponsable e irrazonable para los clientes, simplemente porque no tienen la tecnología para lograr una longitud más larga. Longitud del segmento largo.
9.5. ¿Qué es mejor, el apareamiento o * * *?
* * *Los resultados de la transformación y el procesamiento son los mismos, pero el método de transferir el plásmido de la biblioteca a las células de levadura no tiene ningún impacto en la selección posterior de la biblioteca y puede seleccionarse libremente según los hábitos experimentales del profesor.