Hibridación antígeno-anticuerpo
Preparación de anticuerpos monoclonales
En 1975, Kühler y Milstein informaron por primera vez del uso de glóbulos rojos de oveja (SRBC) para inmunizar esplenocitos y células de mieloma de ratón mediante fusión. , se estableció la primera línea celular de hibridoma de células B y se preparó con éxito un anticuerpo monoclonal anti-srbc (mcab). Hasta la fecha se han desarrollado miles de anticuerpos monoclonales en el mundo.
Los anticuerpos monoclonales tienen propiedades físicas y químicas muy uniformes, actividad biológica única, fuerte especificidad para unirse a antígenos, fácil procesamiento manual y control de calidad, y por lo tanto, han sido bienvenidos y valorados como tales. tan pronto como salieron. En el campo de la medicina, los anticuerpos monoclonales desempeñan un papel muy importante en el diagnóstico de enfermedades, el juicio del pronóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades y el estudio de los mecanismos de las enfermedades. Por este motivo, los dos inventores recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1984.
Sección 1: Principios básicos de la tecnología de hibridoma
El principio básico de la tecnología de anticuerpos de hibridoma es fusionar dos tipos de células manteniendo sus características principales. Estas dos células son células de mieloma de ratón inmunizadas con antígenos. Las principales características de los linfocitos del bazo son su función de secreción de anticuerpos y la capacidad de crecer en medios selectivos (consulte el principio de selección más adelante), mientras que las células de mieloma de ratón pueden dividirse y proliferar indefinidamente en condiciones de cultivo y se denominan células inmortales. Bajo la influencia de medios de cultivo seleccionados, sólo los híbridos de células B y células de mieloma pueden tener la capacidad de continuar proliferando y formar clones celulares con función de secreción de anticuerpos e inmortalidad celular. Su principio se explica a partir de los siguientes pasos principales.
(A) Selección y fusión de células
La tecnología de hibridoma se establece para preparar anticuerpos monoclonales contra antígenos, por lo que el lado de la célula de fusión debe seleccionar células B inmunes al antígeno, generalmente de células Monument en animales inmunizados. El bazo es un lugar importante para la acumulación de células B. Independientemente del estímulo inmunológico, el bazo tendrá una respuesta de anticuerpos significativa. La otra cara de la fusión de células es mantener la proliferación celular después de la fusión celular, una propiedad que sólo tienen las células tumorales. Seleccionar células del mismo sistema puede aumentar la tasa de éxito de la fusión. El mieloma múltiple es un tumor maligno del linaje de células B, por lo que es un compañero de fusión ideal de los esplenocitos. Actualmente, las cepas de tumores de células B comúnmente utilizadas incluyen P3-x63-ag8 (k￠hlerandmilstein, 1975), P3-NSI/1-Ag4-1 (k￠hlerandmilstein, 1976) y x6. Sp2/0-ag14 (Schulmanthal, 1978) y otros. Estas líneas celulares son todas líneas celulares sensibles a los sombreros.
El uso de agentes de fusión celular provoca un cierto grado de daño en las membranas celulares, haciendo que las células se adhieran fácilmente entre sí y se fusionen entre sí. El mejor efecto de fusión debería ser el menor grado de daño celular y la mayor frecuencia de fusión. El polietilenglicol (PEG 1000 ~ 2000) es actualmente el agente de fusión celular más utilizado, con una concentración de aplicación general del 40% (p/v).
(2) Aplicación de medios selectivos
La fusión celular es un proceso físico aleatorio. En suspensiones de células mixtas de esplenocitos de ratón y células de mieloma de ratón, las células fusionadas aparecen en diversas formas. Por ejemplo, esplenocitos y células tumorales fusionados, esplenocitos y esplenocitos fusionados, células tumorales y células tumorales fusionadas, esplenocitos no fusionados, células tumorales no fusionadas y formas poliméricas de células. Las células del bazo normales sólo pueden sobrevivir en el medio de cultivo durante 5 a 7 días, y la forma polimérica de las células muere fácilmente sin una selección especial. Sin embargo, las células tumorales no fusionadas requieren una detección y eliminación especiales.
Generalmente existen dos formas de sintetizar el ADN celular. La vía principal es sintetizar nucleótidos a partir de azúcares y aminoácidos y luego sintetizar ADN. En este proceso de síntesis participa el ácido fólico, como coenzima importante. Otra vía auxiliar es la síntesis de ADN en presencia de hipoxantina y timidina, catalizada por la hipoxantina fosforribosa convertasa (hgprt) y la timidina quinasa (tk). Hay tres componentes clave en el medio selectivo para la fusión celular: hipoxantina (H), metotrexato (A) y timidina (T), por lo que el prefijo de estos tres componentes se denomina medio HAT. El metotrexato es un antagonista del ácido fólico que impide que las células tumorales sinteticen ADN a través de vías normales. Las células tumorales utilizadas para la fusión eran líneas celulares hgprt seleccionadas de un medio tóxico, por lo que no pueden crecer en este medio. Sólo las células fusionadas tienen las características genéticas de ambos padres y pueden sobrevivir y reproducirse en el medio HAT durante mucho tiempo (Figura 11-1).
(3) Limitación de la dilución y selección de la especificidad del antígeno
En la inmunización animal, se deben seleccionar antígenos de alta pureza. Un antígeno suele tener múltiples determinantes. La respuesta inmune humoral producida por un animal después de ser estimulado por un antígeno es esencialmente la secreción de anticuerpos por muchos grupos de células B. Sin embargo, sólo una minoría de células B se dirige al epítopo objetivo. Debido a que la fusión celular es un proceso estocástico, una proporción significativa de células fusionadas requiere una cuidadosa detección y eliminación. El proceso de detección generalmente se divide en dos pasos: en primer lugar, la detección de anticuerpos de las células de fusión y, en segundo lugar, la detección de anticuerpos específicos basados en estas. Diluir completamente las células fusionadas para que el número de células distribuidas en cada pocillo de la placa de cultivo esté entre 0 y varias células (el 30% de los pocillos son 0 para garantizar que cada pocillo sea una sola célula) y tomar el sobrenadante después del cultivo. Líquido, utilice ELISA para detectar células con alta secreción de anticuerpos; este proceso a menudo se denomina clonación.
Estas células positivas se clonan nuevamente y se encuentran líneas celulares positivas para anticuerpos contra el antígeno diana mediante ELISA recubiertas con antígenos específicos. Después de la proliferación, se congelan, se cultivan in vitro o se inoculan en la cavidad abdominal de los animales.