Pida a los estudiantes de biología que le ayuden a presentar la "PCR"
1. Descripción general de la PCR
1. ¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se llama secuencia de ADN específica in vitro. clonación molecular libre o amplificación enzimática dirigida por cebador. Fue inventado por el Dr. Mullis del Departamento de Genética de PE (Perkin Elmer), un científico estadounidense. Debido a la importancia histórica de la tecnología de PCR en teoría y aplicación, Mullis ganó el Premio Nobel de Química en 1993.
2. Historia del desarrollo de la tecnología PCR
El principio de la PCR está mediado por un par de cebadores, que pueden amplificar rápidamente enzimáticamente genes específicos (ADN) in vitro en animales y plantas. fragmento. Después de la amplificación de N ciclos térmicos, el número de genes específicos en el producto de amplificación es (1+e) n (0 La reacción en cadena de la polimerasa ha experimentado cuatro generaciones de productos desde 1993: La primera generación: amplificación genética en baño de agua artificial/robótica Como se muestra arriba. En la figura, se utilizan tres baños de agua a temperatura constante para mantener las temperaturas de los tres baños de agua a tres temperaturas: la temperatura de desnaturalización de alta temperatura de la PCR (como 94 °C), la temperatura de renaturalización a baja temperatura (como 58 °C) y la temperatura de extensión de temperatura adecuada (como 72 °C). Luego use una canasta que contenga tubos de ensayo de muestra de PCR para bañarse en baños de agua de diferentes temperaturas a mano y use un cronómetro para cronometrar la constante. tiempo de temperatura de la muestra en cada baño de agua De esta manera, la muestra de PCR puede completar la siguiente forma de ciclo térmico: 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 45 segundos, 72°C. durante 60 segundos 40 ciclos Las características de este método son: alta intensidad de trabajo para los experimentadores, fácil de causar Los errores son causados por la fatiga las ventajas son: equipo simple, baja inversión; , no se requiere proceso de calentamiento y enfriamiento en comparación con un amplificador genético completamente automático, el tiempo experimental es corto y el experimento está más cerca de las condiciones ideales de reacción de PCR. Los hechos han demostrado que los resultados experimentales son buenos, pero dado que el tubo de muestra está expuesto. El aire por un corto tiempo al pasar de un baño de agua a otro, si la velocidad del movimiento no es lo suficientemente rápida, también causará interferencia de temperatura en la muestra, afectando los resultados. Otras desventajas de este método incluyen que solo puede limitarse a. tres pasos de temperatura (algunas reacciones de PCR requieren más de tres pasos de temperatura), contaminación líquida y es difícil calentar la temperatura del agua a una temperatura de desnaturalización de 94 °C en el área de baja presión. mejorar la automatización de este método En el mismo nivel, se diseñó un dispositivo manipulador para reemplazar el proceso mencionado anteriormente de mover muestras manualmente, y se formó un instrumento manipulador de amplificación de genes en baño de agua. Esta mejora resolvió el problema de la alta intensidad. trabajo para los experimentadores, pero también provocó un largo recorrido de las piezas del manipulador y un alto fallo causado por el movimiento relativo frecuente. Este tipo de amplificador genético se vendió en Beijing y Shanghai a mediados de la década de 1990 y tuvo una contribución positiva. con el desarrollo de la biología molecular en nuestro país y posteriormente fue utilizándose paulatinamente ha sido sustituido por amplificadores con un mayor grado de automatización y actualmente es poco utilizado por unidades Segunda Generación: Amplificador Genético Cualitativo Controlado Automáticamente. En comparación con el amplificador de baño de agua mencionado anteriormente, algunas personas lo llaman el amplificador de gen seco más representativo, incluidas la tercera y cuarta generación introducidas posteriormente, que se basan en la segunda generación e integran un. parte de detección cuantitativa. Tercera generación: punto final cuantitativo/semicuantitativo La segunda generación de PCR cualitativa solo puede determinar negativos y positivos, pero no puede evaluar la concentración y el análisis cuantitativo de específicos. La PCR cuantitativa puede al menos lograr las siguientes funciones que no se pueden lograr con la PCR cualitativa: ? Detección de la concentración de virus latente ? /p> ? Revisar ? Detección de carga viral durante el período de recuperación Desde que la empresa estadounidense ABI inventó el primer instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en 1996, la tecnología y las aplicaciones de la PCR se han desarrollado rápidamente desde lo cualitativo a lo cuantitativo. La ventaja de la PCR cuantitativa de punto final es la baja inversión en equipos. Para las instituciones de investigación científica y las instituciones médicas que no pueden permitirse costosos instrumentos de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real en condiciones económicas nacionales, pueden utilizar los instrumentos de PCR cualitativos convencionales de segunda generación existentes y agregar un detector cuantitativo de fluorescencia de punto final de PCR de un solo pocillo dedicado. para empezar a trabajar y ejercer un efecto de control cuantitativo. La tecnología de PCR cuantitativa de punto final es un producto intermedio en la transición de lo cualitativo a lo cuantitativo en tiempo real. Hay menos productos importados y más instrumentos nacionales, como el TL988 de Xi'an Tianlong y el DA620 de Shanghai Lingguang. La cuarta generación: PCR cuantitativa en tiempo real Instrumento QCPR cuantitativo en tiempo real + reactivo cuantitativo de fluorescencia en tiempo real + computadora general + software de análisis automático constituyen el QPCR-DNA/RNA Sistema de detección cuantitativa de fluorescencia en tiempo real. Vea la imagen a continuación: (omitida) 2. Ventajas de la PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real: Este equipo consta de un sistema cuantitativo de fluorescencia y un Computadora para monitorear la fluorescencia durante el ciclismo. Una computadora conectada al dispositivo en tiempo real recopila datos de fluorescencia. Los datos se muestran en forma de gráficos a través del software de análisis en tiempo real desarrollado. Los datos sin procesar se representaron como intensidad de fluorescencia versus número de ciclos. Una vez que haya recopilado los datos sin procesar, puede comenzar a analizarlos. El software del dispositivo en tiempo real puede normalizar los datos adquiridos para compensar las diferencias en la fluorescencia de fondo. Después de la normalización, se puede establecer un nivel de umbral, que es el nivel en el que se analizan los datos de fluorescencia. El número de ciclos por los que pasa una muestra cuando alcanza un nivel umbral se denomina valor Ct (número de ciclos en el punto límite). El umbral debe establecerse para maximizar la eficiencia de amplificación durante la fase exponencial para obtener los datos más precisos y reproducibles. Si también hay estándares etiquetados con las concentraciones correspondientes, el análisis de regresión lineal producirá una curva estándar que se puede usar para calcular la concentración de la muestra desconocida. 3. Principio de la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real. La llamada tecnología Q-PCR en tiempo real se refiere al método de agregar genes fluorescentes al sistema de reacción de PCR, utilizando la acumulación de señales fluorescentes para monitorear todo el proceso de PCR en tiempo real, y finalmente analizando cuantitativamente la plantilla desconocida a través de la curva estándar. En el desarrollo de la tecnología en tiempo real, dos descubrimientos importantes desempeñan un papel clave: (1) A principios de la década de 1990, el descubrimiento de la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Taq puede degradar sondas fluorescentes específicas, lo que permite la detección indirecta de productos de PCR. (2) Luego, use sondas fluorescentes con doble etiqueta para monitorear todo el proceso de reacción en tiempo real en un tubo de reacción sellado. La combinación de estos dos descubrimientos y el desarrollo comercial de los instrumentos y reactivos correspondientes llevaron a la aplicación de la Q-PCR en tiempo real en trabajos de investigación. El número de copias de ADN producidas durante la reacción de PCR aumenta exponencialmente. A medida que aumenta el número de ciclos de reacción, la reacción de PCR final ya no genera plantilla exponencialmente y entra en una fase de meseta. En la PCR tradicional, la separación por electroforesis en gel y la tinción fluorescente se utilizan a menudo para detectar el producto de amplificación final de la reacción de PCR, por lo que no es confiable cuantificar los productos de PCR mediante este método de criterio de valoración. En la Q-PCR en tiempo real, todo el proceso de amplificación de la reacción de PCR se monitorea en tiempo real y la señal de fluorescencia relacionada con la amplificación se analiza continuamente. A medida que avanza el tiempo de reacción, los cambios en la señal de fluorescencia monitorizada se pueden trazar como una curva. En las primeras etapas de la reacción de PCR, el nivel de fluorescencia no se puede distinguir claramente del fondo. Luego, la generación de fluorescencia ingresa a la fase exponencial, fase lineal y fase de meseta final. Por lo tanto, la cantidad de producto de PCR se puede detectar en un cierto nivel. punto en la fase exponencial de la reacción de PCR e inferir de este el contenido inicial de la plantilla. Para comparar fácilmente las muestras detectadas, es necesario establecer un cierto umbral de señal de fluorescencia durante la fase exponencial de la reacción de Q-PCR en tiempo real. Este umbral generalmente utiliza la señal de fluorescencia de los primeros 15 ciclos de la reacción de PCR como señal de fondo de fluorescencia. La configuración predeterminada es 65438 de la desviación estándar de la señal de fluorescencia durante 3 a 15 ciclos. Si la señal de fluorescencia detectada excede el umbral, se considera una señal verdadera y se puede utilizar para definir el número de ciclo umbral (Ct) de la muestra. El significado del valor Ct es: el número de ciclos experimentados cuando la señal de fluorescencia en cada tubo de reacción alcanza el umbral establecido. Los estudios han demostrado que existe una relación lineal entre el valor Ct de cada plantilla y el logaritmo del número de copia inicial de la plantilla. Cuanto mayor sea el número de copias inicial, menor será el valor de Ct. Se puede preparar una curva estándar utilizando un estándar con un número de copia inicial conocido. Por lo tanto, siempre que se obtenga el valor Ct de una muestra desconocida, el número de copia inicial de la muestra se puede calcular a partir de la curva estándar. 4. Aplicación de la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real en el tratamiento médico. ⑴Detección de patógenos: la tecnología de detección de PCR cuantitativa por fluorescencia se puede utilizar actualmente para detectar gonococos, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, virus del papiloma humano, virus del herpes simple, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, virus de la influenza, detección cuantitativa de patógenos. como Mycobacterium tuberculosis, virus de Epstein-Barr y citomegalovirus. En comparación con los métodos de detección tradicionales, tiene las ventajas de alta sensibilidad, menor consumo de muestra, rápido y sencillo. Por ejemplo, la importancia del diagnóstico genético de la tuberculosis es principalmente: A. Distinguir Mycobacterium tuberculosis de otras micobacterias B. genes; C. Mejorar la tasa de detección positiva de la tuberculosis. ⑵Diagnóstico prenatal: hasta ahora, las personas no pueden tratar las enfermedades hereditarias causadas por cambios en el material genético. Solo pueden reducir el nacimiento de bebés enfermos mediante el control prenatal, evitando así la aparición de diversas enfermedades hereditarias. Por ejemplo, para reducir el nacimiento de niños con enfermedades genéticas ligadas al cromosoma X, se aísla el ADN fetal de la sangre periférica de mujeres embarazadas y se detectan los genes de la región determinante del sexo Y mediante una PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real. Método no invasivo y fácilmente aceptado por las mujeres embarazadas. ⑶Evaluación de la eficacia de los medicamentos: El análisis cuantitativo del virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) muestra que la cantidad de virus está relacionada con la eficacia de ciertos medicamentos. La expresión del VHC de alto nivel es insensible al tratamiento con interferón, mientras que la expresión del VHC de bajo título es sensible al tratamiento con interferón. Durante el tratamiento con lamivudina, el nivel sérico de ADN-VHB disminuyó durante un tiempo y luego volvió a aumentar o superó el nivel anterior, lo que indica que el virus había mutado. Por ejemplo, la aplicación y la importancia de la PCR en la detección del VHB; A. Comprender la cantidad de virus de la hepatitis B en el cuerpo. B. Si se debe copiar. C. ¿Es contagioso y qué tan contagioso es? D. ¿Es necesario tomar medicamentos? E. Si los cambios anormales en la función hepática son causados por virus. F. Determinar qué tipo de fármaco antiviral es el adecuado para el paciente. G. Determinar la eficacia del tratamiento farmacológico. ⑷Detección de genes tumorales: Aunque aún no se ha aclarado la patogénesis de los tumores, está ampliamente aceptado que las mutaciones en genes relacionados son la causa fundamental de la transformación oncogénica. El aumento de la expresión de oncogenes y las mutaciones pueden aparecer temprano en muchos tumores. La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real no solo puede detectar eficazmente mutaciones genéticas, sino también detectar con precisión la expresión de oncogenes. Actualmente, este método se ha utilizado para detectar la expresión del gen hTERT de la telomerasa, el gen WT1 de la leucemia mielógena crónica, el gen ER del tumor, el gen PSM del cáncer de próstata, genes de virus relacionados con tumores, etc. Con el descubrimiento de nuevos genes relacionados con tumores, la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia desempeñará un papel más importante en la investigación de tumores. (5) Aplicación en eugenesia: En los últimos años, con el rápido desarrollo de la economía y la mejora del nivel de vida de las personas año tras año, la gente está prestando cada vez más atención a la salud de ellos mismos y de sus familias, especialmente la salud de la próxima generación. Además, debido a la paulatina profundización del trabajo de planificación familiar en nuestro país, el número de hijos únicos ha aumentado y la aptitud física de los niños se ha convertido en el foco de atención de los mayores. Por lo tanto, se ha vuelto muy importante cómo mejorar la calidad de los recién nacidos y la calidad genética de los humanos, es decir, la eugenesia y la atención posnatal. ① Evitar el nacimiento de personas con enfermedades hereditarias graves y enfermedades congénitas. ② Promover la reproducción de individuos con excelente fuerza física e inteligencia. Entre ellos, prevenir el nacimiento de personas con enfermedades genéticas graves y enfermedades congénitas es el contenido más básico de la eugenesia y la educación. Desde la perspectiva de la eugenesia clínica, el trabajo específico incluye pruebas genéticas de madres y fetos durante el embarazo, tratar de descartar nacimientos con enfermedades genéticas comunes y verificar si la madre tiene Toxoplasma gondii, virus de la rubéola, clamidia y otras infecciones que fácilmente pueden causar enfermedades fetales. Malformaciones durante el embarazo. En el pasado, el análisis cromosómico se utilizaba principalmente para detectar enfermedades genéticas, pero en la práctica clínica, la mayoría de las enfermedades genéticas son enfermedades genéticas en lugar de enfermedades cromosómicas y no pueden detectarse mediante análisis cromosómico. Si utiliza la amplificación de genes por PCR combinada con análisis de polimorfismo de conformación monocatenario (sscp), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFCP), hibridación de puntos de ácido de oligonucleótido específico de alelo o PCR diferencial, puede detectar fácilmente mutaciones en un solo gen. Y la precisión puede alcanzar más del 95%, por lo que este problema se ha resuelto bien. Los patógenos infecciosos comunes que pueden causar fácilmente malformaciones fetales incluyen el virus del herpes simple (HSV), el virus de la rubéola (RV), el citomegalovirus humano (HCMV), TOX y Chlamydia trachomatis (CT). En el pasado, era difícil diagnosticar infecciones por estos patógenos, que se diagnosticaban principalmente mediante métodos de cultivo. Sin embargo, el método de cultivo requiere mucho tiempo y es costoso, y se ve afectado por el muestreo, la conservación de muestras y la medicación, y no puede promoverse clínicamente. Debido a su alta sensibilidad y especificidad, el método de amplificación de genes por PCR es muy adecuado para el diagnóstico y seguimiento de la eficacia de estas enfermedades, siendo el método de detección más recomendado. 1. Aplicación del método de amplificación de genes por PCR en el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas. Las enfermedades hereditarias son enfermedades causadas por cambios genéticos que conducen a determinadas funciones, defectos o anomalías en el organismo. El cambio fundamental radica en el material genético. Sus tipos incluyen enfermedades genéticas de un solo gen, enfermedades genéticas cromosómicas y enfermedades genéticas poligénicas. Además de preguntar sobre antecedentes médicos, diagnóstico físico general, exámenes de laboratorio generales y comprensión de síntomas y signos, el diagnóstico de enfermedades genéticas también tiene sus propias particularidades. En el pasado, el análisis genealógico, la tinción cromosómica y de género se utilizaban habitualmente como base principal para el diagnóstico de enfermedades genéticas, complementados con los análisis enzimáticos pertinentes para realizar el diagnóstico. Con el rápido desarrollo de la biología molecular y su aplicación generalizada en el diagnóstico de enfermedades genéticas, nació la tecnología de diagnóstico genético, que ha promovido en gran medida el diagnóstico clínico de enfermedades genéticas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las principales técnicas de diagnóstico genético. Esta tecnología de amplificación de genes in vitro, rápida y sensible, puede detectar la mayoría de las mutaciones genéticas, deleciones de genes, desalineaciones cromosómicas, etc. La tecnología de PCR se está convirtiendo cada vez más en uno de los métodos más eficaces y fiables para diagnosticar enfermedades genéticas. He aquí algunos ejemplos de importancia universal en China. (1) Detectar la talasemia mediante PCR; la talasemia es una anemia hemolítica crónica hereditaria y la enfermedad genética de un solo gen más común y común en el mundo. La tasa de incidencia es mayor en Guangdong, Guangxi, Guizhou, Sichuan y otros lugares, alcanzando el 15% en Guangxi y otros lugares. La talasemia es causada por una mutación genética que conduce a un desequilibrio de la globina, lo que reduce o incluso deja de sintetizar cadenas peptídicas con estructura normal, manifestándose como anemia hemolítica. Los tipos de genes receptores se dividen en α, β y γ, entre los cuales las talasemias α y β son las más comunes y las más dañinas. El grupo de genes de globina se encuentra en el brazo corto del cromosoma 6 humano. Hay dos genes repetidos ubicados en α1 y α2. Los dos genes α y sus secuencias flanqueantes tienen una gran homología y son propensos a un intercambio cromosómico desigual, lo que resulta en la eliminación del gen α. -α Talasemia. La deleción parcial de genes de α-talasemia incluye la deleción parcial del gen α1, la deleción del gen α2, la deleción simultánea de los genes α1 y α2 y la talasemia sin deleción. La PCR se puede utilizar para amplificar los genes α1 y α2 y detectar si estos genes están eliminados o mutados para diagnosticar la α-talasemia. Los defectos genéticos en la β-talasemia se manifiestan principalmente como mutaciones de un solo nucleótido en la secuencia del gen, o deleciones o inserciones de algunas bases, que reducen o eliminan la síntesis normal de la cadena peptídica de β-globina. Para el diagnóstico se puede utilizar la hibridación puntual de productos de PCR con sondas de oligonucleótidos específicas de sitio (Aso). (2) Fenilcetonuria: La fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad genética autosómica recesiva. Debido a la conversión de la fenilpropionato hidroxilasa en tirosina, la fenilalanina y sus metabolitos se acumulan en el cuerpo, provocando daño cerebral y retraso mental irreversible. Las personas con PKU nacen normales. Una vez que a un recién nacido se le diagnostica PKU, suspender la lactancia materna y tomar un tratamiento oral bajo en fenilalanina durante 8 a 10 años puede mantener el desarrollo intelectual normal del paciente. Porque el bajo contenido de fenilalanina oral es muy caro e inasequible para las familias comunes y corrientes. Por lo que el diagnóstico prenatal es la mejor opción para prevenir el nacimiento de un niño. La HAP solo se expresa en las células del hígado y su actividad enzimática no puede analizarse mediante células sanguíneas, fibroblastos, líquido amniótico o células de vellosidades coriónicas, y solo puede diagnosticarse a través de genes. El cambio genético de la PKU no es la eliminación de todos los genes de la PAH. La forma principal es una mutación puntual con muchos sitios de mutación. La detección debe realizarse mediante amplificación por PCR, ASO, SSCP o análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AmpFLA). Estas técnicas son complejas y los inspectores deben recibir una formación especializada. (3) La hemofilia es un grupo de los trastornos hereditarios de la coagulación más comunes. Se puede dividir en dos tipos según los diferentes defectos de los factores (defectos del factor VIII y VIII), que también son complejos. Hemofilia, pero menos común. La tasa de incidencia de la hemofilia A es de 1/10.000. El gen del factor VIII se encuentra cerca del gen G6PD y tiene una longitud total de 186 Kb. Los reordenamientos genéticos extensos (deleciones, inserciones y duplicaciones) causan muy pocos casos de hemofilia A y representan sólo el 5% de los defectos del factor VIII. La mayoría de los pacientes muestran mutaciones de una o unas pocas bases. Dado que el gen del factor VII tiene una longitud de 186 Kb, tiene muchos sitios de mutación y una alta frecuencia de nuevas mutaciones, es imposible detectar cada mutación desde una perspectiva clínica. Se pueden detectar varios tipos de mutaciones comunes. El principal método de detección es la PCR combinada con el análisis RELP. La hemofilia B representa el 20% de los casos de hemofilia y sus cambios genéticos y métodos de detección son similares a los de la hemofilia A. (4) Desarrollo sexual anormal. La base material para distinguir a hombres y mujeres son los cromosomas sexuales. En el desarrollo embrionario de los mamíferos, el fenotipo femenino no requiere ninguna regulación, mientras que el fenotipo masculino está determinado por muchos factores. El gen ubicado en el cromosoma Y que dirige el SSS masculino se llama determinante testicular (TDF). La investigación moderna muestra que el gen SRY (región determinante del sexo del cromosoma Y) es un gen TDF, ubicado al final del brazo corto del cromosoma Y. La eliminación de la región SRY hace que la ontogenia del cariotipo 46XY se desarrolle fácilmente en mujeres. Las pruebas genéticas pueden detectar translocaciones y deleciones en el genoma SRY para diagnosticar anomalías en el desarrollo sexual. Esta investigación que explora las anomalías de género es bienvenida. Además, también hay un paciente con una anomalía del cariotipo 46XY, concretamente feminización testicular, que se debe a la eliminación del gen del receptor de andrógenos (AR), lo que hace que el gen diana de los andrógenos no responda o responda de forma incompleta a los andrógenos. Existen diferentes fenotipos según la afección. La deficiencia de AR tiene una alta frecuencia de nuevas mutaciones y se presenta como una enfermedad esporádica sin antecedentes familiares. El gen AR tiene una longitud de 90 Kb y está ubicado en el cromosoma X. Las anomalías del gen AR son en su mayoría mutaciones de bases en genes individuales, que pueden detectarse mediante PCR combinada con ASO o SSCP. (5) El síndrome de X frágil (FRAX) es un síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X (XLMR) con la tasa de incidencia más alta. Debe su nombre a que el síndrome está asociado con un sitio frágil en el cromosoma X. La mayoría de los hombres de FRAX tienen un coeficiente intelectual inferior a 50 y existe una tendencia a que el coeficiente intelectual disminuya a medida que envejecen. Se aisló un clon de YAC que cubre el sitio X-frágil mediante tecnología de clonación de cromosomas de levadura artificial (YAC), y de este clon se obtuvo un gen que puede expresarse en el cerebro humano, denominado FMR-1 (fragile lag-1). Hay una cadena de trinucleótidos CGG (CGG)n en el extremo 5' de FMR-1. Hay polimorfismos en (CGG)n en la población normal, con 6-46 repeticiones. Cuando el número de repeticiones supera las 52, la división de la región es inestable, lo que resulta en un gran aumento en el número de repeticiones. Las inserciones de vectores sin manifestaciones clínicas tienen menos de 500 bg de longitud y son clínicas. La gente considera 500 pb como la línea divisoria entre la premutación y la mutación completa. Antes del diagnóstico de Frax, se utilizaba la citogenética para detectar sitios frágiles, pero las condiciones experimentales eran estrictas y la tasa de éxito no era alta. Actualmente, la premutación y las mutaciones completas se pueden diagnosticar mediante genética molecular. Amplifique la secuencia repetida CGG mediante PCR y detecte la longitud del producto amplificado. El fragmento amplificado del gen mutado se amplifica y, cuando se produce heterogeneidad somática, aparecen múltiples bandas amplificadas de diferentes longitudes o incluso una cola, o el fragmento de inserción de mutación completa amplificado no se amplifica porque es demasiado largo y excede la capacidad de amplificación por PCR. .aumentar el fenómeno. 2. Aplicación de la tecnología de amplificación de genes por PCR en el diagnóstico de "Torsch". En las primeras etapas del embarazo (1-3 meses), algunos microorganismos patógenos pueden provocar fácilmente malformaciones fetales. Los patógenos más comunes son el virus Tox, el virus de la rubéola (RV), el virus del herpes simple (HSV), Chlamydia trachomatis (CT) y el citomegalovirus (HCMV). (1) La detección por PCR de Toxoplasma gondii muestra que los focos naturales de Toxoplasma gondii están muy extendidos y que la mayoría de las infecciones en el cuerpo humano son infecciones latentes y pueden ocurrir manifestaciones clínicas cuando la resistencia es baja. El diagnóstico de Toxoplasma gondii es difícil y los métodos serológicos son muy sensibles, pero hay falsos positivos cruzados y es imposible determinar una infección reciente, una infección a largo plazo o una infección transitoria. El método de diagnóstico es la biopsia o la biopsia animal. La tasa positiva de estos métodos es demasiado baja y difícil de promover. La prueba de PCR puede detectar 1 o 2 patógenos en muestras con alta precisión y actualmente es el mejor método para detectar Toxoplasma gondii. Como control prenatal y posnatal, se debe extraer una muestra de sangre completa antes o durante el primer trimestre. El EDTA o la heparina se pueden utilizar para la anticoagulación. El EDTA tiene el mejor efecto anticoagulante y se utiliza para detectar la presencia de TOX en los leucocitos de sangre periférica. Las pruebas de toxoplasma tienen una importancia clínica más importante para las mujeres que son infértiles, tienen abortos espontáneos recurrentes o crían animales pequeños. (2) Infección por el virus de la rubéola: el virus de la rubéola (RV) es un único virus de ARN positivo y los seres humanos son el único huésped del virus de la rubéola. La infección por VD puede causar malformaciones fetales y afectar el desarrollo del sistema inmunológico fetal, por lo que las pruebas del VD son muy importantes en la atención prenatal y posnatal. El RV se puede detectar mediante cultivo directo y pruebas de anticuerpos IgM. Los métodos de cultivo requieren mucho tiempo y, a menudo, otros virus interfieren con ellos. El método IgM no es exacto, pero el método PCR es sensible, específico, sencillo y rápido, y es uno de los mejores métodos de detección de la infección por RV. Después de que el virus de la rubéola invade el cuerpo, se multiplica en el tracto respiratorio superior, provoca síntomas y pápulas en la cara y se propaga rápidamente por todo el cuerpo. Las muestras incluyen hisopos de garganta, suero, vellosidades de mujeres embarazadas o líquido amniótico de mujeres embarazadas. El virus RV es un virus de ARN y la amplificación por PCR es relativamente complicada. Preste atención al momento de la recolección de la muestra y a la precisión de la operación. (3) Virus del herpes simple: El virus del herpes simple (VHS) es un virus de ADN que puede causar inflamación de múltiples órganos y puede transmitirse a través del contacto sexual. La tasa de recurrencia de la infección por HSVⅱⅱ es alta y el 80% de las personas infectadas recaen en 12 meses. Una vez que el sistema inmunológico elimina la infección por HSV, un pequeño número de pacientes la portan de por vida y recaen cuando están débiles. La detección por PCR del VHS es sensible y puede identificar directamente el VHS tipo I/II. (4) Chlamydia trachomatis, Chlamydia trachomatis (CT) es una enfermedad de transmisión sexual, que no solo puede causar tracoma sino también causar infección de órganos de vida o muerte. A diferencia de las enfermedades de transmisión sexual clásicas, como la gonorrea (NG) y la sífilis, la TC se transmite fácilmente a través de otras vías de contacto. Los resultados de las encuestas realizadas a mujeres embarazadas en algunas áreas muestran que la tasa de incidencia en esta población llega al 20% -30%. En países como Europa y Estados Unidos, la infección por CT ha superado a la gonorrea y ocupa el primer lugar entre las enfermedades de transmisión sexual. La infección por clamidia suele ser una infección latente sin síntomas o síntomas específicos, lo que dificulta su diagnóstico. Los métodos de cultivo anteriores consumían mucho tiempo y carecían de sensibilidad y precisión. Cuando se utiliza la PCR para la detección por TC, se debe prestar atención al uso de diferentes materiales para diferentes propósitos de detección. Para el diagnóstico de enfermedades de transmisión sexual, se deben tomar secreciones del tracto reproductivo (células exfoliadas), y para pacientes con embarazo temprano, se deben verificar muestras de sangre completa y luego se deben verificar las secreciones vaginales en el tercer trimestre o durante el parto para guiar la limpieza. del canal de parto. (5) La infección por células gigantes humanas (HCMV) es muy común, excepto algunas infecciones primarias acompañadas de mononucleosis primaria, la mayoría de ellas son infecciones latentes. El HCMV puede permanecer inactivo en el cuerpo durante mucho tiempo. Cuando la función inmune del cuerpo es baja, el virus puede activarse y causar enfermedades graves. Si las mujeres embarazadas se infectan con HCMV durante el embarazo, esto puede provocar parto prematuro, malformaciones, muerte fetal y enfermedad de inclusión de células gigantes neonatal. El CMVH pertenece a la familia de los virus del herpes y puede secretarse en la saliva, la orina, las secreciones cervicales y la leche materna. La prueba de diagnóstico "estándar de oro" para el CMVH es el cultivo viral que utiliza monocapas de fibroblastos, y otras pruebas experimentales incluyen pruebas serológicas y pruebas de cuerpos de inclusión. La PCR es un nuevo método de detección de HCMV y las muestras utilizadas para la detección incluyen sangre, hisopos de secreciones del tracto reproductivo, etc. Cuando se utiliza para la atención prenatal y posparto, se deben recolectar muestras de sangre. Para las pacientes con infección por HCMV al comienzo del embarazo, se debe volver a analizar el líquido amniótico u otros productos del embarazo, y se debe realizar un seguimiento cuidadoso de las pacientes para tomar decisiones integrales y tomar las medidas médicas correspondientes. La aplicación de la PCR en eugenesia tiene grandes ventajas, por lo que el impulso y aplicación de esta tecnología acaba de comenzar. Preste atención a la precisión de la cirugía y trate de evitar diagnósticos erróneos. Para enfermedades infecciosas, primero se deben tomar muestras de sangre de mujeres embarazadas para realizar pruebas. Cuando hay sospecha o se detecta ácido nucleico patógeno en la sangre, se deben realizar pruebas de líquido amniótico y otras pruebas a la mujer embarazada lo antes posible. Independientemente de si se sospecha que el feto tiene una susceptibilidad genética grave y un riesgo moderado de malformación debido a una infección, se deben respetar las opiniones de los padres del feto. 5. Algunas aplicaciones de la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real en investigación. Primero, la investigación y el desarrollo de nuevos medicamentos, medicamentos para humanos y otros medicamentos. Para algunos medicamentos para enfermedades infecciosas, como diversas enfermedades virales y bacterianas, en el proceso de desarrollo de nuevos medicamentos. investigación y desarrollo, puede ahorrar mucha mano de obra, tiempo y dinero para la investigación y el desarrollo de nuevos medicamentos. En comparación con Elisa y otros métodos utilizados anteriormente, la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real puede determinar de forma rápida, precisa, cuantitativa y sensible el contenido de patógenos en sangre o tejido, ayudando así a analizar los efectos de los medicamentos y comparar la eficacia de diferentes formulaciones. Posología y costo. Este método se puede utilizar no sólo para medicamentos para humanos, sino también para medicamentos para animales, e incluso se puede utilizar para la investigación de medicamentos en otros animales y plantas económicos, por lo que su rango de aplicación en la investigación de medicamentos es muy amplio. El segundo es el desarrollo de medicamentos y terapias para infecciones ultra tempranas. La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real se utiliza para determinar el contenido de ácido nucleico viral en la sangre, por lo que hay no es necesario esperar a que el cuerpo del paciente produzca anticuerpos. Al mismo tiempo, debido a que su sensibilidad no es la misma que la de Elisa, se puede determinar en las primeras etapas de la infección viral, es decir, cuando el nivel del virus en la sangre es muy bajo. Por lo tanto, ha surgido un nuevo campo, que es cómo usar el medicamento cuando el contenido de virus o bacterias es muy bajo, qué medicamento usar, cuánto medicamento usar, etc., para contribuir a la eliminación de la enfermedad a un nivel ultra bajo. etapa temprana. 3. Investigación sobre la eficacia de los medicamentos, medicamentos para humanos y otros medicamentos. Para algunos medicamentos nuevos que han estado en el mercado o medicamentos antiguos que se han utilizado durante mucho tiempo, el efecto , la dosis y el tiempo de uso de los medicamentos se pueden estudiar más a fondo para estudiar más a fondo la aplicación racional de estos medicamentos en beneficio de la humanidad. Debido a que los métodos utilizados en el pasado no pueden cuantificar con precisión y no son lo suficientemente sensibles, hay muchas cosas que deben estudiarse. Por un lado, hay mucho que vale la pena estudiar en este campo y también es de gran importancia. En cuarto lugar, estudiar nuevos indicadores de pronóstico. Para las enfermedades infecciosas, se cree que el medicamento se puede suspender después de alcanzar un cierto nivel, pero actualmente no existe un indicador claro de cuándo hacerlo. detener la droga. Debido a limitaciones en la sensibilidad y precisión de los métodos de detección, este indicador puede no ser razonable. Por lo tanto, es necesario estudiar más a fondo el índice de curación y su relación con la tasa de recurrencia y la transformación de la enfermedad en otras enfermedades, a fin de sentar una base teórica sólida para que los medicamentos o terapias curen completamente la enfermedad. Verbo (abreviatura de verbo) para desarrollar nuevos reactivos de diagnóstico y prueba Muchos métodos de detección de diagnóstico existentes no pueden cumplir con los requisitos de rapidez, sensibilidad y cuantitativa al mismo tiempo, como los existentes El método de cultivo y el método Elisa, y el método de PCR cuantitativa de fluorescencia pueden hacer esto, desarrollando así nuevos reactivos para enfermedades clínicas, inspección de productos básicos, inspección de granos y aceites, inspección de alimentos, análisis de sangre, etc. , mejorando así la sensibilidad, velocidad y precisión de la inspección. Hay muchos tipos de este tipo de reactivos y los beneficios sociales y económicos de los reactivos desarrollados son enormes. 6. Tasa de detección fallida en análisis de sangre Dado que la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real es mucho más sensible que Elisa, las estaciones de sangre o los institutos de investigación de sangre generalmente la utilizan para estudiar la tasa de detección fallida. de Elisa, es decir, las muestras de sangre negativas para Elisa se analizaron y volvieron a analizar mediante PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real. Durante la repetición de la prueba, generalmente se mezclan 24 muestras de sangre negativas para Elisa en una sola muestra para la prueba. Utilizando este método, se encontró un caso de VIH en la sangre utilizada por Shanghai Blood Products. Mediante pruebas realizadas al donante, se confirmó que el paciente era VIH positivo. El Centro de Sangre de la Cruz Roja de Beijing está calculando la tasa de detección perdida de 50.000 muestras de sangre negativas para Elisa de la Estación de Sangre de Beijing. Debido a que los reactivos, métodos y números de lote de Elisa utilizados en diferentes regiones son diferentes, este trabajo debe realizarse en diferentes regiones. Debido a sus características rápidas, sensibles y cuantitativas, la PCR cuantitativa por fluorescencia tiene muchas aplicaciones en investigación y desarrollo, como el estudio de la relación entre el genotipo individual y la eficacia de un fármaco. Los investigadores también pueden desarrollar nuevos usos para sus propios proyectos de investigación. Introducción del producto del sistema de detección por PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real TL988 1. Cómo elegir un instrumento de PCR adecuado Revisando el desarrollo de la biología molecular, la invención de la tecnología PCR y su Popularización es sin duda uno de los capítulos más importantes. Entre el continuo desarrollo e innovación de la tecnología de PCR en los últimos 20 años, la más llamativa es la PCR cuantitativa en tiempo real (ORQPCR). La tecnología de PCR cuantitativa realmente ha logrado un salto de la PCR cualitativa a la cuantitativa. Al monitorear el proceso de PCR en tiempo real, la concentración inicial de la plantilla se puede cuantificar con precisión de manera específica, sensible, rápida y reproducible, y se ha utilizado cada vez más en la investigación científica y el diagnóstico clínico. Nuestra empresa parte del principio de la PCR cuantitativa de fluorescencia e introduce en detalle los tipos y tecnologías de los instrumentos de PCR cuantitativa de fluorescencia, proporcionando una referencia detallada para la selección de instrumentos de PCR cuantitativa. El instrumento de PCR cuantitativa consta principalmente de dos partes, una es el sistema de PCR y la otra es el sistema de detección de fluorescencia. A partir de la introducción del principio anterior, no es difícil ver la clave para elegir un instrumento de PCR cuantitativa, porque la PCR cuantitativa debe cuantificarse comparando muestras y estándares, para un sistema de PCR cuantitativa, el parámetro importante no es solo la precisión del control de la temperatura. , la velocidad de subida y bajada de temperatura, etc. PCR tradicional y uniformidad entre pocillos de muestra para evitar que se multipliquen pequeñas diferencias. En cuanto a los sistemas de detección de fluorescencia, la detección multicolor y multicanal es la tendencia principal en la actualidad: cuantos más canales de excitación tenga el instrumento, más tipos de fluoresceína tendrá y más amplio será el ámbito de aplicación del instrumento; canal significa que se puede detectar una muestra al mismo tiempo. Con múltiples fluoróforos en el instrumento, el instrumento puede detectar simultáneamente múltiples plantillas o estándares internos + muestras en un solo tubo. Cuantos más canales, más amplio será el rango aplicable y mayor será el rendimiento del instrumento. El sistema de detección de fluorescencia incluye principalmente una fuente de luz de excitación y un detector. Las fuentes de luz de excitación incluyen fuentes de luz halógena de tungsteno, láseres de iones de argón y fuentes de luz LED. Los primeros pueden equiparse con filtros multicolores para lograr diferentes longitudes de onda de excitación, mientras que los LED de un solo color son económicos, consumen menos energía y tienen una larga vida útil. Pero debido a que es monocromático, se necesitan diferentes LED para lograr mejor diferentes longitudes de onda de excitación. El sistema de monitoreo incluye un sistema de imágenes CCD de temperatura ultrabaja y un tubo fotomultiplicador. El primero puede obtener imágenes de varios puntos a la vez, mientras que el segundo es muy sensible pero sólo puede escanear una muestra a la vez. Detectar múltiples muestras escaneo por escaneo lleva mucho tiempo. Otro factor que debe considerarse para los instrumentos de PCR cuantitativa es el diseño del software. Actualmente, los instrumentos más nuevos cuentan con un buen software de soporte para satisfacer el uso diario. -Con la aplicación de la tecnología PCR cuantitativa en el diagnóstico clínico de enfermedades