¿Quién puede informarme sobre la extracción de teicoplanina? Por favor cuéntamelo.
En vista del hecho de que T-A2 es fácilmente soluble en agua, solución acuosa de acetona y solventes orgánicos como metanol y etanol, T-A2 se puede extraer del caldo de fermentación mediante solvente. extracción. Bardone[J] et al. utilizaron disolventes orgánicos insolubles en agua, como hidrocarburos clorados C1-C4 o alcanoles C4-C6 para extraer T-A2 por primera vez. Primero, filtrar el caldo de fermentación, ajustar el pH del filtrado a 3,5 con ácido clorhídrico al 10% (que contiene una pequeña cantidad de cloruro de sodio), luego extraerlo con butanol y luego extraer el filtrado con butanol.
El producto bruto se obtiene mediante centrifugación, concentración, enfriamiento y precipitación a alta velocidad. Lavar el micelio con agua, ajustar el pH a 3,5 con ácido clorhídrico al 10%, extraer con solución acuosa de acetona (8:2) y evaporar la acetona para mantener PI-I 3,5 sin cambios. Extraer con butanol, centrifugar, concentrar y enfriar para precipitar el producto bruto. La pureza del producto bruto combinado fue del 64,8 % mediante HPLC y ensayos microbiológicos. Otra patente informa sobre un método de extracción ligeramente mejorado. Es decir, disolventes orgánicos solubles en agua, como acetona, acetonitrilo, n-propanol, metiletilcetona, dimetilsulfóxido, etc. Añadir directamente al caldo de fermentación acidificado (pH = 3 ~ 4) para agregar T-A2, eliminar el micelio por centrifugación o filtración y concentrar parcialmente y enfriar la solución para precipitar T-A2 crudo. El rendimiento es del 64,5% al 88,7%. Comparado con el método de dos pasos anterior, este método es simple de operar y mejora el rendimiento.
2 Método de adsorción
T-A 'El principio antibacteriano se combina con UDP-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamil-L-lisina El grupo carboxilo libre al final de La acil-D-alanina (pentapéptido UDP) se combina estrechamente, concretamente D-Ala-D-Ala, para formar T-A2 y N,N-diacetil-L-lisil-1.
El complejo alanil-D-alanina interfiere con la síntesis normal de las paredes celulares, inhibiendo así el crecimiento bacteriano. ¿Prueba además que T-A2 tiene una alta afinidad por el péptido que termina en D-Ala-D-A1A (Ka = 1,5 × 106)? j. Según este mecanismo, el medio de afinidad bioselectiva se puede preparar eficazmente uniendo el dipéptido D-Ala-D-Ala o el polipéptido X-D-Ala-D-Ala (X es un residuo de aminoácido) al portador y. purificación de T-A2. Su portador de afinidad puede utilizar sustancias macromoleculares como agar, dextrano, celulosa, poliestireno o polímero de ácido acrílico, y está conectado con D~Ala~D-Ala o X-D-Ala-D-Ala mediante una reacción de reticulación para formar una afinidad. portador y medio. Alternativamente, se puede conectar un vehículo con un "brazo" (tal como ácido 6-aminocaproico, N-hidroxisuccinimida o cadena de ácido graso) al fragmento peptídico anterior para formar un medio de afinidad, y directamente la fermentación. caldo Empaque en una columna con este medio de afinidad. Los experimentos han demostrado que este método puede separar y purificar eficazmente antibióticos glicopeptídicos, especialmente los derivados Corti de T-A2 y T-1, etc. T-1 se purificó directamente del caldo de fermentación usando Sepharos 4B-D-Ala-D-Ala. Después de cargarlo en la columna, se desorbe con tampón alcalino para obtener t con una pureza de aproximadamente 94%.
-A, el rendimiento alcanza el 65%. Y este medio de afinidad también se ha utilizado con éxito para concentrar y purificar T-A2 en orina y plasma. Folena-Wasser-Man et al. utilizaron el gel AFI 10-D-AA-D-Ala para purificar T-1 y lograron buenos resultados.
La solución de desorción puede ser una solución tampón alcalina, como bicarbonato de amonio (incluido acetonitrilo) con pH 9,50,4 mol/l, bicarbonato de sodio (incluido acetonitrilo) con pH 9,25 mol/l, PHLL 0,1 mol /l de amoníaco (50% acetonitrilo), solución tampón de fosfato de cloruro de sodio Phil 0,15 mol/l. Los experimentos han demostrado que los desorbentes con un pH en el rango de 10 ~ 11,5+0,5 son eficaces y su tasa de desorción puede alcanzar más del 97%. Dado que hay muchas impurezas en el caldo de fermentación, si se aplica directamente a la columna, inevitablemente contaminará la columna cromatográfica con el tiempo. Por lo tanto, antes de cargarlo en la columna, el caldo de fermentación se puede separar preliminarmente, como filtración, extracción, precipitación y otros procesos. Esto no solo puede aumentar la vida útil de la columna cromatográfica, sino también mejorar su efecto de adsorción. También se ha demostrado que el T-A2 se puede separar y purificar bien utilizando resina de poliamida basada en el principio de adsorción molecular.
Después de la purificación preliminar, el caldo de fermentación se ajustó a pH 5,8 y luego se pasó a través de una columna de resina de poliamida (CC-6, SC-6, cc6Ac, sc6Ac) y se eluyó con una solución acuosa de metanol (9:1). Evaporar el metanol en el eluyente, agregar acetona, enfriar a baja temperatura (5°C) o ajustar el pH al punto isoeléctrico para precipitar T-A2 con una pureza de 85. Además, en la purificación preliminar del caldo de fermentación, si el micelio se separa a un pH de 10,5 a 11, al menos el 90 % del producto entrará en el filtrado, por lo que se puede producir Tekola en este paso.
El rendimiento total del proceso de purificación de Ning aumentó en un 50%.
3 Método de intercambio iónico
A juzgar por la estructura química del T-1, tiene un grupo amino y un grupo carboxilo y es un compuesto anfótero. Por eso se puede extraer con resina de intercambio iónico. La resina de intercambio catiónico (IR120 o Dowex50) se utiliza por primera vez como vehículo de purificación. Más tarde, hubo un informe de patente que utilizaba una resina de sal sódica fuerte de poliestireno divinilbenceno sulfonato de sodio DOW [XFS-43278.002] para purificar T-A2. Coloque la resina en el caldo de fermentación, revuelva a temperatura ambiente durante 6 horas, lave la resina saturada con agua, luego coloque la resina en una pastilla de solución de hidróxido de sodio 0,5, mantenga el pH constante, revuelva durante 2 horas, filtre la resina y luego se desaliniza y concentra. Se obtiene el producto terminado T-A2. Dado que el uso de resina de intercambio iónico ácida aumentará la degradación de la parte de azúcar de T-A2, la resina de intercambio iónico básica fuerte aumentará fácilmente la epimerización de T-A2, y la resina de intercambio iónico no se puede usar eficazmente para purificar T-A2 debido a una selectividad deficiente, por lo que las perspectivas de aplicación de este método no son optimistas y pocos periodistas lo han visto.
4 Cromatografía Líquida
La cromatografía líquida es un método eficaz para separar e identificar compuestos. Puede separar y purificar eficazmente mezclas complejas. Borghij et al. separaron con éxito el T-A2 obtenido mediante cromatografía en papel y cromatografía en capa fina utilizando cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, y obtuvieron cinco componentes individuales, T-A2-L ~ T-A2-5. El proceso es el siguiente: el T-A2 obtenido mediante extracción con disolvente u otros métodos se disuelve en formiato de amonio-acetonitrilo al 0,2% (9:1) como disolvente.
Añadir 1 mol/L de NaOH para ajustar el pH a 7,5, introducirlo en una columna de HPLC preparativa (columna de gel de sílice silanizada), eluir linealmente con una solución mixta de 10% ~ 20% de acetonitrilo y 0,2% formiato de amonio y recolectar paso a paso, usar análisis e identificación por HPLC, combinar soluciones con distribuciones de HPLC similares y concentrar a presión reducida para eliminar el disolvente orgánico. El concentrado se preparó mediante HPLC preparativa y se eluyó con acetonitrilo al 50 %. Después de concentrar el eluido, se precipitaron T-A2-L y T- añadiendo acetona-éter dietílico (1:1).
Un pie y dos pulgadas T ~ A2, T-A24 y T-A2 se pueden obtener mediante HPLC semipreparativa (Whatman Partisil ODS M-9) usando formiato de amonio-acetonitrilo al 0,2% (76:24). ) Desorber, desalar y precipitar. Cometti et al. también utilizaron cromatografía líquida preparativa de baja presión (columna Jobin-Yron) para purificar T-A2 (fase móvil Ci43cn/Nai-'I2po4 (27/23)). Zhang Lihua et al. utilizaron cromatografía en lecho móvil simulada para estudiar las condiciones de purificación de la teicoplanina y lograron buenos resultados. Pero por ahora, el método aún se encuentra en etapa de laboratorio. Además, según datos coreanos, T-A2 se purifica actualmente mediante una combinación de método con disolvente y HPLC, y el rendimiento es de aproximadamente el 65 %.
Referencias-Progreso de la investigación de la tecnología de refinación de teicoplanina-Wang Zengxia, Wu Ming, Jiang Ning