Principio y aplicación de la expresión del gen ATAC+ multiómico unicelular de 10x Genomics
La expresión génica ATAC+ multiómica unicelular es una solución multiómica unicelular lanzada por 10x Genomics que puede obtener mapas de expresión génica y accesibilidad de cromatina de la misma célula al mismo tiempo, mejorando así. La distinción de las células terminales diferenciadas finales y los tipos de células a lo largo de las trayectorias de desarrollo revela interacciones complejas entre elementos reguladores, cromatina abierta y expresión génica.
1. Principio de la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular de 10x Genomics
Para obtener el transcriptoma y el epigenoma de la misma célula al mismo tiempo, 10x Genomics single -La tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica celular utiliza por primera vez la transposasa Tn5 para transponer el ADN nuclear en una suspensión nuclear celular. La transposasa Tn5 corta preferentemente el ADN nuclear en regiones abiertas de cromatina. Luego, la plataforma Chromium se utiliza para la expresión génica unicelular (GEX) y la preparación de la biblioteca ATAC. Este proceso envuelve un núcleo de una sola célula, reactivos de reacción y una sola perla de gel (Gel Bead) en una gotita (GEM). Las perlas de gel también incluyen una secuencia poli(dT) con un código de barras específico (código de barras 10x), un identificador molecular único (UMI) y una secuencia espaciadora con código de barras 10x. La secuencia poli(dT) puede capturar colas de poli(dA). El ARNm se utiliza para generar bibliotecas de expresión génica (GEX) y la secuencia espaciadora puede agregar códigos de barras a los fragmentos de ADN transpuestos para generar bibliotecas ATAC. Secuenciar las dos bibliotecas obtenidas y hacer coincidir los datos de secuenciación de las dos bibliotecas de la misma célula mediante un código de barras 10x para lograr una correlación simultánea del transcriptoma y el epigenoma de la misma célula.
2. Ventajas de la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular de 10x Genomics
1. Una célula, dos interpretaciones
Multiómico unicelular 10x Genomics -La tecnología de expresión génica ATAC+ de -omics puede hacer un uso completo de las muestras y obtener información tanto del transcriptoma como del epigenoma de una célula, maximizando la adquisición de conocimientos multicapa a partir de muestras limitadas.
La Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford en Estados Unidos utilizó la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular de 10x Genomics para obtener líneas celulares de cáncer colorrectal COLO320-DM (oncogén MYC amplificado en ecDNA) y COLO320- del Se obtuvieron mapas de accesibilidad de cromatina y transcriptoma emparejados en un total de 72.049 células de HSR (oncogén MYC amplificado en amplicones cromosómicos en tándem (HSR)). La agrupación celular de datos de ATAC-seq unicelular y RNA-seq unicelular muestra una agrupación independiente de líneas celulares COLO320-DM y COLO320-HSR. En relación con el HSR cromosómico COLO320-HSR amplificado con MYC, la expresión de ARN y las puntuaciones de accesibilidad de MYC fueron altamente heterogéneas en el COLO320-DM amplificado con MYC, lo que sugiere que la actividad variable de los elementos reguladores puede explicar las diferencias celulares en la expresión de oncogenes.
2. Combine los dos resultados de agrupación para identificar con mayor precisión los tipos de células.
La tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular de 10x Genomics puede utilizar simultáneamente dos conjuntos de datos de transcriptoma y epigenoma. Realice agrupaciones de células en datos para caracterizar mejor la heterogeneidad celular de poblaciones de células complejas y descubrir conocimientos ocultos. Además, las firmas epigenéticas se pueden interpretar más fácilmente utilizando marcadores de expresión genética.
Investigadores del Broad Institute del MIT y la Universidad de Harvard utilizaron la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular para obtener epigenomas y transcripciones de alta calidad a partir de 34.774 células de piel de ratón adulto, según el atlas del Grupo. El análisis de estos dos datos encontró que no solo se pueden distinguir tipos de células de diferentes linajes, sino también tipos de células estrechamente relacionados, como αCD 34+ alto versus αCD 34+ bajo. Los grupos celulares basados en ARN también se pueden distinguir por las características de accesibilidad de la cromatina, lo que confirma aún más su identidad; por ejemplo, la anotación de grupos basada en la actividad de los determinantes del linaje reveló los activadores transcripcionales globales Dlx3 y Sox9 y el represor Zeb1 y Sox5 et al. Algunos estados celulares pueden identificarse con mayor resolución mediante cromatina o firmas de expresión genética, por ejemplo, la agrupación de grupos de células basada en firmas de agrupación reveló diferencias más pronunciadas en la accesibilidad de la cromatina entre las partes permanentes y regenerativas de los folículos pilosos, por el contrario, las células correspondientes a la capa granular son más; Se distingue fácilmente como un grupo distinto en el nivel de expresión genética.
3. Correlación del transcriptoma y el epigenoma para descubrir nuevos efectos reguladores de genes
La tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular de 10x Genomics puede combinar elementos reguladores con la expresión génica. Explorar las interacciones reguladoras de genes. que impulsan la diferenciación celular, el desarrollo y la enfermedad.
Investigadores de la Universidad de Washington aplicaron la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular al tejido renal de ratones macho de 8 semanas de edad y obtuvieron mapas de accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma de 11.296 células y encontraron asociaciones. entre 1.260 sitios remotos y 321 genes. El 44% de los sitios estaban asociados con el TSS más cercano y el 21% estaban asociados con el segundo TSS más cercano. La correlación más alta se da entre el gen marcador de células del túbulo distal Slc12a3 y un sitio 36 kb aguas abajo de su TSS, superponiéndose a su último exón. La accesibilidad de este sitio es ligeramente específica de las células del túbulo distal alto. Los vínculos entre los elementos reguladores cis distales y sus genes diana son útiles para explicar la expresión diferencial en diferentes tipos de células. Por ejemplo, la expresión específica del tipo celular de Slc6a 18 (un gen marcador para las células S3 del túbulo proximal tipo 2) no se refleja en la accesibilidad del promotor específico del tipo celular y su TSS está asociado con un sitio a 16 kb de distancia. Accesibilidad de este sitio. se correlaciona con la expresión Slc6a18.
3. Campos de aplicación de la expresión del gen ATAC+ multiómico unicelular de 10x Genomics
Debido a las limitaciones de los monoómicos, poco después de la aparición de ATAC-seq unicelular tecnología de secuenciación, ATAC unicelular Se adoptó una estrategia de aplicación simultánea de tecnologías -seq y RNA-seq unicelular. En la actualidad, esta estrategia se ha utilizado ampliamente en diferentes campos, como el desarrollo de órganos, la investigación de mecanismos de enfermedades y cáncer, y se han publicado un total de casi 50 artículos. El método de utilizar directamente la tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular para analizar el transcriptoma y el epigenoma de la misma célula también se ha aplicado a la corteza cerebral de ratones neonatales y adultos, a células de cáncer de pulmón tratadas con dexametasona, a riñón de ratón y a embriones de ratón. Tejidos como el prosencéfalo y la piel del ratón durante las etapas de desarrollo. En diciembre de 2020, también se informó sobre el primer estudio que utilizó la tecnología de expresión génica ATAC+ unicelular de 10x Genomics para estudiar el centro de ecDNA que impulsa la expresión de oncogén cooperativo intermolecular.
1. Caso: El análisis de expresión del gen ATAC+ multiómico unicelular revela el mecanismo de determinación del linaje en la piel de ratón
Publicado: noviembre de 2020
Publicado por : Broad Institute del MIT y la Universidad de Harvard, etc.
Revista publicada: Cell
Factor de impacto: 38,637
1) Antecedentes de investigación
La diferenciación y función celular están reguladas en múltiples niveles de regulación genética, incluida la regulación de la expresión genética a través de cambios en la accesibilidad a la cromatina. Sin embargo, la diferenciación es un proceso asincrónico, lo que dificulta la comprensión actual de los eventos regulatorios que conducen a las decisiones sobre el destino celular.
2) Materiales y métodos
Tecnología de expresión génica ATAC+ multiómica unicelular (SHARE-seq), piel, pulmón y tejido cerebral de ratón.
3) Resultados de la investigación
a. El análisis multiómico no solo puede distinguir tipos de células de diferentes linajes, sino que también puede distinguir tipos de células estrechamente relacionadas basadas en ARN; distinguirse por las firmas de accesibilidad de la cromatina confirman aún más la identidad; algunos estados celulares se pueden identificar con mayor resolución a través de firmas de cromatina o expresión génica;
b. Se identificaron 63.110 asociaciones de genes pico en piel de ratón adulto, con algunos picos individuales asociados con 4 o más genes. Las regiones de cromatina reguladora asociada a genes (DORC) de pico alto se superponen con los superpotenciadores.
c.DORC está fuertemente enriquecido con genes reguladores clave conocidos para la determinación de linajes cruzados. Existen diferencias significativas en los DORC incluso entre poblaciones de células estrechamente relacionadas, lo que indica que los DORC son altamente específicos del tipo de célula.
d. Los DORC a menudo se vuelven accesibles antes de que comience la expresión de sus genes asociados, lo que coincide con el inicio del linaje. Durante mucho tiempo se ha planteado la hipótesis de que la activación del potenciador predice la expresión del gen diana e implica la accesibilidad a la cromatina como un sello distintivo del inicio del linaje.
e. Los cambios en todo el genoma en la accesibilidad de la cromatina reflejan el estado celular de inicio del linaje, y el potencial de la cromatina puede predecir estados celulares futuros en escalas de tiempo más grandes que la velocidad del ARN, particularmente durante el período de diferenciación.
Referencias:
1. King L. Hung, Kathryn E. Yost, Liangqi Xie, et al. Los centros de EcDNA impulsan la expresión cooperativa de oncogenes intermoleculares.[J].bioRxiv, 2020.11. 19.390278.
2. Ma Sai, Zhang Bing, LaFaveLindsay M et al. Potencial de cromatina identificado mediante perfiles unicelulares compartidos de ARN y cromatina.[J].Cell, 2020, 183: 1103-1116. e20.
3. Cao Junyue, Cusanovich DarrenA, Ramani Vijay et al. Perfiles conjuntos de accesibilidad a la cromatina y expresión genética en miles de células individuales. [J]. Science, 2018, 361: 1380-1385.