Habilidades de aplicación de la membrana de nitrocelulosa.
1. El principio de unión de la proteína y la membrana
El principio de unión de la proteína y la membrana Las fuerzas de unión conocidas incluyen fuerza hidrofóbica, enlace H, fuerza electrostática, etc. , el principio vinculante exacto aún no está claro y se basa principalmente en hipótesis. Hay dos hipótesis principales:
1) Primero mediante la unión de fuerzas electrostáticas y luego mediante el enlace H y la interacción hidrofóbica durante un largo tiempo.
2) Primero combine mediante interacción hidrofóbica y luego combine mediante interacción electrostática durante mucho tiempo.
Ambas hipótesis indican que el proceso de vinculación se divide en dos pasos, primero la vinculación y luego la vinculación larga. Debido a la ambigüedad de los principios combinatorios, el trabajo en este campo depende en gran medida de la experiencia práctica.
2. El efecto de la membrana en la unión
1) Tamaño de los poros de la membrana
Algunos técnicos tienden a utilizar el tamaño de los poros de la membrana para distinguir diferentes membranas, pero tenga en cuenta , esto se limita a productos del mismo fabricante. Si los productos son de diferentes fabricantes, esta comparación no tiene sentido. La relación entre el tamaño de los poros de la membrana y la velocidad cromatográfica se ha descrito anteriormente.
A medida que disminuye el tamaño de los poros de la membrana, aumenta la superficie real disponible de la membrana y también aumenta la cantidad de proteínas unidas a la membrana. El parámetro utilizado para estimar el área de superficie es la relación de área de superficie (la relación entre el área de superficie disponible real y el área plana de la membrana utilizada).
Además, cuanto menor es el tamaño de poro de la membrana, menor es la velocidad de la cromatografía, más tiempo tarda el complejo marcado con oro en pasar a través de la línea T y más completa es la reacción.
Basándonos en los dos puntos anteriores, podemos concluir que cuanto menor sea el tamaño de los poros de la membrana, mayor será la sensibilidad. Pero también ralentiza el proceso y aumenta la posibilidad de que se produzcan enlaces no específicos, es decir, un mayor número de falsos positivos. Por lo tanto, es necesario seleccionar una membrana adecuada para el proyecto real según los resultados de las pruebas y encontrar el punto de equilibrio adecuado.
2) Diferencias entre membranas de diferentes fabricantes
Esta diferencia proviene principalmente de dos puntos:
1 gt a la hora de producir las membranas, los polímeros y las superficies utilizadas; Las fuentes, tipos y cantidades de agentes activos varían. Asimismo, en el procesamiento de membranas, estas dos sustancias generalmente tienen un gran impacto en el rendimiento.
El proceso de tratamiento de 2 gt es diferente.
3. Fórmulas de materias primas biológicas, reactivos y soluciones tampón.
1) Las materias primas biológicas se utilizan como materias primas biológicas para las líneas de CT y se utilizan en diferentes situaciones. una breve introducción.
En primer lugar, los anticuerpos monoclonales se unen mejor a las membranas que los anticuerpos policlonales, principalmente porque los anticuerpos policlonales tienen muchos sitios de superficie diferentes y las condiciones óptimas de unión de cada sitio a la membrana son ligeramente diferentes, lo que sin duda aumenta. La dificultad de la optimización.
En segundo lugar, cuanto mayor es el peso molecular, más difícil resulta para la proteína unirse a la materia sólida.
2) Solución tampón
Lo que más puede preocupar a la gente es obtener una fórmula con un rendimiento excelente, incluyendo solución tampón, solución bloqueadora, etc.
De hecho, no puedo darte una lista de fórmulas generales. Porque diferentes sistemas de reacción requieren diferentes fórmulas que los respalden, y los sistemas de reacción de diferentes instituciones también son diferentes. Si quieres conseguir "pescado", primero debes aprender a pescar. Para no engañar a todos, solo proporcionaré ideas sobre las siguientes cuestiones relacionadas con las fórmulas. Explore usted mismo la fórmula específica.
Generalmente, la solución tampón consta de PBS (u otro sistema tampón), sustancia activa (para un problema concreto) y ajuste de pH. Después de consultar información anterior, mi opinión personal es que el principio de la fórmula debe ser simple y sencillo, y las sustancias activas deben agregarse según sus propias necesidades. Muchas sustancias activas que originalmente era necesario agregar ya no son necesarias gracias a las mejoras en la tecnología de fabricación de películas.
El sistema tampón recomendado es PBS PH7-7.2 0,01 M, que tiene buena adaptabilidad a diversos antígenos y anticuerpos.
Las sustancias activas se enumeran a grandes rasgos de la siguiente manera:
Una pequeña cantidad de NACL puede reducir la intensidad de la señal y eliminar los falsos positivos.
El alcohol orgánico (metanol, alcohol isopropílico, etc.) humedece la película, reduce la electricidad estática transportada por la película y es beneficioso para unir el recubrimiento. Personalmente, no lo recomiendo debido a las mejoras en la tecnología de producción cinematográfica.
Los agentes tensioactivos (TW20, TX100) pueden aumentar la hidrofilicidad, evitar líneas huecas y aumentar el color.
El azúcar, un agente protector, puede ralentizar el envejecimiento y aumentar la hidrofilicidad.
Ajustar el pH a una determinada posición puede eliminar falsos positivos.
4. Ambiente de la muestra
La humedad ambiental es muy importante para el proceso de deposición de la película. La humedad óptima es generalmente de 45 a 65ºC.
Cuando la humedad es demasiado baja, las cargas estáticas tienden a acumularse en la película y tienden a aparecer motas en la película, lo que resulta en manchas hidrofóbicas durante la prueba.
Cuando la humedad es demasiado alta, la acción capilar sobre la película se fortalece y la película punteada puede hacer que las líneas de TC se ensanchen o incluso se extiendan fácilmente.
Para garantizar la uniformidad de la humedad de la membrana durante el muestreo, la membrana generalmente se coloca bajo esta condición de humedad durante un período de tiempo antes del muestreo.
5. Relación entre el equipo de muestreo y las condiciones de la superficie de la membrana.
Actualmente existen dos métodos de muestreo, a saber, el tipo de película raspada y el tipo de película sin punto de contacto. El tipo de película de punto sin contacto es mejor que el tipo de película raspadora, y el tipo de película raspadora importada es mejor que el tipo de película raspadora nacional.
Debido a que el método de raspado utiliza una manguera para raspar los anticuerpos en la superficie de la película, y las propiedades físicas de la película en sí son suaves y quebradizas, el tubo de raspado dejará rastros en su superficie. Debido a que la máquina raspadora de película importada utiliza mejores materiales y sistemas de control, los rayones que quedan son más leves, mientras que los instrumentos nacionales son más pobres y los rayones que quedan son más graves. Los rayones pueden formar fácilmente resistencia al complejo cromatográfico marcado con oro, lo que genera falsos positivos. Al mismo tiempo, si hay líneas finas (líneas fantasma) en la línea T durante la carrera, también es fácil que aparezcan.
6. Ancho de la película y posición del punto de luz
El ancho de la película es generalmente de 18 mm (o 20 mm) y 25 mm, que se utilizan para el papel de prueba y la placa de prueba, respectivamente.
Pero diferentes posiciones de muestreo de la línea T traerán diferentes sensibilidades. Cuando la posición de muestreo se mueve hacia arriba, la velocidad del compuesto marcado con oro que pasa a través de la posición de la línea T disminuirá, el tiempo de reacción aumentará y la sensibilidad aumentará. De lo contrario, la sensibilidad se reducirá. Este método se puede utilizar para variar la sensibilidad y eliminar falsos positivos.
7. Difusión de la solución sobre la membrana
En general, la cantidad de muestra de solución sobre la membrana es de 1ul/cm.
La difusión de la solución sobre la membrana tiende a ambos extremos, y el punto de pulverización es una solución uniforme de anticuerpos. Sin embargo, al secar, la velocidad de secado en el borde de la línea es mayor que en el medio, y los anticuerpos en el medio continuarán difundiéndose hacia ambos lados, por lo que los anticuerpos se acumularán en ambos extremos de la línea después del secado. Generalmente no afectará sus experimentos. Si encuentra que ambos extremos de la línea son rojos y el medio es claro, debe considerar este problema. Esto se puede solucionar añadiendo las sustancias activas mencionadas anteriormente.
8. Efecto de sellado antes y después de aplicar la película
Las películas compradas a proveedores están básicamente optimizadas y se pueden utilizar directamente. Sin embargo, a menudo nos encontramos con discusiones sobre el cierre.
De hecho, el cierre no es lo que todo el mundo piensa. Una vez cerrado, todo encajará en su lugar. El viejo problema desapareció y ha vuelto a aparecer un nuevo problema, que es aún más problemático. Lo que intento decir es utilizar los cierres con precaución.
Estoy totalmente en contra del método de sellar primero y aplicar película después. La razón es que cuando los fabricantes producen películas, se mezclan varias fórmulas con la pulpa original. Cuando sellan la película antes de puntear, deben remojar la película en el líquido sellador, lo que inevitablemente alterará la distribución normal de las sustancias en la película. Esto causó muchos problemas y redujo la eficiencia del trabajo. Algunos fabricantes encuentran el problema de no poder filmar sin sellar. De hecho, se pueden utilizar otros métodos para resolver el problema. Se debe probar la película sellante.
Hay dos técnicas de sellado que utilizo habitualmente.
El flujo se cierra y el material activo se procesa en la plataforma de muestra.
La membrana se sella en puntos fijos y la sustancia activa se mezcla en una solución y se pulveriza en lugares específicos de la membrana. Este método requiere el uso de boquillas de chorro de aire de BIODOT, que pueden resucitar paneles semiacabados de calidad inferior.
Mientras la membrana esté sellada, inevitablemente afectará la estabilidad del producto. El grado específico de impacto debe juzgarse mediante pruebas de estabilidad.
9. Almacenamiento de la película
Las películas recién producidas generalmente contienen entre un 5 y un 10 % de humedad. El mecanismo de envejecimiento de la película tiene apoyo teórico pero es controvertido. Según la teoría, el envejecimiento de la película se debe a la evaporación del agua en la película, lo que hace que la película sea hidrofóbica, cargada y quebradiza. El requisito general para almacenar películas es sellarlas y protegerlas de la luz. Demasiado seco o demasiado húmedo es perjudicial. En tales condiciones de almacenamiento, generalmente se puede almacenar durante dos años.
Sin embargo,
Debido a problemas en el proceso de producción, la sensibilidad de algunas membranas cambiará dentro de un período de tiempo después de su uso. Si ocurren tales problemas, la membrana debe colocarse durante un período de tiempo después de realizar el pedido y luego ponerse en depuración y producción una vez que esté estable.