Cómo hacer aerogeles

El aerogel también se llama gelatina. Las partículas coloidales o polímeros en sol o solución se conectan entre sí bajo ciertas condiciones para formar una estructura de red espacial, y los espacios en la estructura se llenan con líquido (o gas en xerogel) como medio de dispersión. Este sistema de dispersión especial se llama gel. No hay liquidez. Suele haber mucho líquido en su interior. Por ejemplo, el contenido de agua del gel sanguíneo y del agar puede alcanzar más del 99%. Se puede dividir en gel elástico y gel quebradizo. Después de que el gel elástico pierde el medio de dispersión, el volumen disminuye significativamente. Cuando el medio de dispersión se reabsorbe, el volumen se vuelve a expandir, tal como la gelatina. Cuando un gel quebradizo pierde o reabsorbe el medio de dispersión, su forma y volumen no cambian, como el gel de sílice. El proceso de formar un gel a partir de una solución o sol se llama gelificación.

[Editar este párrafo] Biología y gel

Los objetos de purificación posteriores de biomoléculas generalmente incluyen proteínas, enzimas, proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales, anticuerpos y antígenos, péptidos, virus, ácidos nucleicos, etc. Antes de la purificación, es necesario determinar las propiedades físicas y químicas de las biomoléculas y luego seleccionar el proceso de purificación más eficaz mediante experimentos.

1. Determinación - peso molecular, PI

Cuando el peso molecular, PI y otras propiedades físicas de la proteína objetivo no están claros, se puede determinar mediante electroforesis PAGE o cromatografía. Las columnas empaquetadas Superose HR con amplio rango de separación son ideales para determinar el peso molecular de proteínas desconocidas. El PI se puede medir fácilmente con una pequeña cantidad de medio de intercambio iónico en varios tubos de ensayo que contienen diferentes tampones de pH y se puede seleccionar el pH óptimo del tampón de purificación.

2. Seleccione un método de cromatografía

Si no sabe mucho sobre las propiedades o la composición de la muestra de su proteína objetivo, puede probar varios métodos de purificación diferentes:

1 ) Utilice el método de filtración en gel más común y elija medios con un amplio rango de separación, como Superose y Sephacryl HR, para separar la muestra en diferentes componentes según el peso molecular.

2) Unir la proteína diana a medios de cromatografía de afinidad que contengan ligandos o anticuerpos específicos. También pueden usarse diversos medios de acoplamiento activados para acoplar sustratos y receptores para proteínas diana y luego usarse para unirse a la proteína diana. Se pueden obtener muestras de alta pureza en un solo paso.

3] Las muestras de gran tamaño suelen concentrarse y purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico. Las muestras eluidas con alto contenido de sal se pueden purificar mediante cromatografía hidrófoba. La cromatografía hidrófoba utiliza el principio de adsorción con alto contenido de sal y elución con bajo contenido de sal. La muestra eluida se puede someter directamente a cromatografía de adsorción, como el intercambio iónico. Estos dos métodos suelen utilizarse indistintamente durante el proceso de purificación.

3. Purificación: una gran cantidad de producto crudo

Para evitar el bloqueo de la columna, al procesar una gran cantidad de solución cruda, se utilizan medios de intercambio iónico de partículas grandes, como las perlas grandes de sefarosa. , SepharoseXL y Sepharose de flujo rápido generalmente se usan en espera. La tecnología de adsorción en lecho extendido utiliza una variedad de medios optimizados para capturar proteínas directamente de caldos de fermentación que contienen células alteradas o extractos de tejido. Centrifugación, ultrafiltración y purificación preliminar en uno. Mejore la tasa de recuperación y acorte el ciclo de purificación.

4. Purificación: el método de precipitación con sulfato de amonio se utiliza a menudo para la purificación preliminar de las muestras. Las muestras procesadas se encuentran en un estado rico en sal y son muy adecuadas para la cromatografía hidrófoba directa. Para el intercambio iónico es necesario desalar primero con Sephadex G-25. La cromatografía hidrofóbica es una tecnología relativamente nueva y, con el creciente número de tipos de medios, se integra gradualmente en varios procesos de producción. El kit de ensayo Hitrap HIC y el kit de ensayo RESOURCE HIC se pueden utilizar para seleccionar los medios más adecuados y las condiciones de purificación óptimas entre ocho medios hidrófobos. Las muestras eluidas con bajo contenido de sal se pueden diluir ligeramente o someter directamente a otra cromatografía de adsorción.

5. Moléculas puras de agua-azúcar

Lectinas inmovilizadas, como concanavalina, maní, cebada, etc. , puede unir residuos de carbohidratos y es ideal para separar componentes glucosilados de membranas celulares, células e incluso orgánulos subcelulares, y purificar glicoproteínas. Dos medios de cromatografía de afinidad Sepharose 6MB con lectinas están diseñados para capturar células enteras o complejos grandes, como vesículas de membrana.

6. Purificación-Proteínas de membrana

A menudo se utilizan detergentes para separar las proteínas de la membrana y mantener su actividad. El detergente iónico debe seleccionarse con una carga opuesta a la proteína objetivo para evitar competir con la proteína objetivo por el medio de intercambio durante el proceso de intercambio iónico, eliminando así el detergente. Los detergentes no iónicos se pueden eliminar mediante cromatografía hidrófoba.

7. Purificación - Anticuerpos monoclonales y antígenos * La mayoría de los anticuerpos monoclonales son IgG. Las principales fuentes son la ascitis y los sobrenadantes de cultivos tumorales confluentes. El líquido ascítico contiene grandes cantidades de albúmina, transferrina y anticuerpos del huésped. Mabselect, la proteína G y la proteína A tienen afinidad específica por la región Fc de IgG y pueden purificar IgG de diferentes fuentes en un solo paso. El complemento sérico, como el suero de ternera, se puede tratar previamente con proteína G y la IgG se puede eliminar antes del cultivo. La proteína A recombinante Mabselect media y la rProtein A Sepharose FF tienen una mayor carga y especificidad para IgG y menos eliminación de población. La proteína A caída se puede eliminar fácilmente mediante intercambio iónico Q Sepharose HP o filtración en gel Superdex 200.

*Cromatografía hidrofóbica Phenyl Sepharose HP también es adecuada para purificar IgG. Los anticuerpos del huésped y la IgG contaminante se pueden eliminar mediante purificación y pulido mediante filtración en gel Superdex 200.

*El método más eficaz para purificar el antígeno IgG es acoplar IgG con medios de acoplamiento activados como CNBr y Sefarosa FF activada por NHs, y luego obtener más antígeno IgG.

*HiTrap IgM es un anticuerpo monoclonal que se utiliza para purificar células tumorales fusionadas. La cantidad de unión es de 5 mg de IgM. HiTrap IgY se utiliza especialmente para purificar IgY, con una capacidad de unión de 100 mg de IgY pura.

8. Purificación - El concepto de purificación debería haberse integrado en el diseño y construcción de proteínas recombinantes. La mayoría de las muestras se mezclan con células rotas o productos lisados, por lo que la tecnología de adsorción en lecho expandido STREAMLINE es muy adecuada para la separación gruesa. Amersham Biosciences ofrece tres sistemas de fusión para una expresión rápida y una purificación en un solo paso.

1] El vector de fusión GST permite que la proteína a expresar se exprese junto con la glutatión S-transferasa, y luego se purifique usando cromatografía de afinidad con glutatión Sefarosa 4B, y luego usando trombina o corte de factor Xa.

2. El vector de fusión de Proteína A fusiona la proteína a expresar con el sitio de unión de IgG de la proteína A y la purifica con IgG Sepharose 6 FF.

2] La proteína de fusión que contiene la etiqueta de histidina puede quelar el metal Ni2+ con agarosa quelante FF y quelar la proteína de fusión a través de histidina en condiciones normales o desnaturalizantes (urea 8M). El kit HisTrap proporciona un conjunto completo de métodos de purificación de proteínas His-Tag.

9. Purificación-proteína del cuerpo de inclusión

La proteína del cuerpo de inclusión a menudo debe disolverse en clorhidrato de guanidina 6 M o urea 8 M. Los medios de filtración en gel Superose 12 y Sepharose 6FF, químicamente estables, son adecuados para la purificación en condiciones desnaturalizantes. Las proteínas desnaturalizadas y purificadas requieren una renaturalización a su conformación nativa. Superdex 75, Q Sepharose FF y Phenyl Sepharose FF ayudan en la renaturalización de las proteínas del cuerpo de inclusión. Cuanto mayor sea la pureza de la muestra de proteína de cuerpos de inclusión, mejor será el efecto de replegamiento. El medio de cromatografía de fase inversa SOURCE 30 RPC es muy adecuado para purificar productos crudos antes de la renaturalización y se puede regenerar con 1MnaOH. La tasa de recuperación de la renaturalización de las proteínas del cuerpo de inclusión purificadas mediante este método mejora significativamente.

10. Renaturalización en fase sólida de proteínas de inclusión* En los últimos años, muchas publicaciones han informado que las proteínas de inclusión se inmovilizan (adsorben) en medios de cromatografía en condiciones desnaturalizantes, generalmente utilizando varios medios de cromatografía de intercambio de iones de Sefarosa FF. . Después de eliminar el desnaturalizante, la proteína se renaturaliza con éxito en el medio de cultivo y luego se eluye. La renaturalización en fase sólida evita la formación de polímeros proteicos durante el proceso de renaturalización general, por lo que el rendimiento de la renaturalización es mayor y no es necesario diluir la muestra en grandes cantidades. La renaturalización y la purificación preliminar se combinan en una sola, lo que ahorra mucho tiempo. y mejora la eficiencia.

Renaturalización directa y purificación mediante cromatografía de afinidad. Ambas columnas preempaquetadas de cromatografía de afinidad son reutilizables y más convenientes y duraderas que los kits comunes.

11. Purificación de principios activos de las hierbas medicinales chinas

La composición química de las hierbas medicinales chinas es extremadamente compleja. La medicina tradicional china se toma principalmente después de la decocción y los ingredientes activos son en su mayoría ingredientes hidrófilos, incluidos alcaloides, flavonoides, antraquinonas, saponinas, ácidos orgánicos, polisacáridos, péptidos, proteínas, etc. Utilice múltiples métodos de cromatografía de manera flexible y completa. Los ejemplos incluyen intercambio iónico, tamices moleculares y cromatografía de fase reversa. El gel de dextrano Sephadex LH-20 tiene las funciones de cromatografía de adsorción y tamiz molecular al mismo tiempo. Por ejemplo, si se utiliza metanol para separar glucósidos flavonoides, primero se eliminan por lavado los trisacáridos, seguidos de los disacáridos, monosacáridos y agliconas. Sephadex LH-20 puede utilizar una variedad de reactivos como agua, etanol, acetona, cloroformo, etc., y se usa ampliamente para la separación de una variedad de productos naturales, incluidos alcaloides, glucósidos, flavonoides, quinonas, lípidos, terpenos, esteroides, etc.

*Los alcaloides se cargan positivamente en tampones ácidos y se convierten en sales. Las columnas de intercambio catiónico HiTrap SP pueden separar una variedad de alcaloides con estructuras muy similares. Por el contrario, los flavonoides, antraquinonas, saponinas y ácidos orgánicos son solubles en tampones alcalinos y tienen mejores efectos de separación en la columna de intercambio aniónico HiTrap Q.

*Generalmente, para purificar polisacáridos se utilizan tamices moleculares como Sephadex y Sephacryl. Si el peso molecular es inferior a 600 KD y se requiere una resolución más alta, puede elegir el Superdex de nueva generación. En general, las plantas pueden contener polisacáridos solubles en agua, solubles en ácidos y álcalis. La utilización integral de tamices moleculares y cromatografía de intercambio iónico ayuda a obtener productos puros de cada componente. Además, los fármacos polisacáridos necesitan eliminar las proteínas, lo que puede provocar alergias. El método tradicional Sevag debe repetirse decenas de veces para desproteinizar el butanol. Los métodos de intercambio aniónico y catiónico pueden eliminar rápidamente las proteínas residuales de los polisacáridos en uno o dos pasos. La cromatografía de fase inversa SOURCE5, 15, 30RPC también es muy adecuada para la detección, separación y preparación de amplificación de diversos ingredientes activos de la medicina tradicional china. Dado que los ingredientes de la medicina tradicional china son muy complejos, el rango utilizable de cromatografía de fase inversa es PH1-14, y se puede lavar y regenerar con NaOH 1 M y HCl 1 M. En comparación con la cromatografía de fase reversa en gel de sílice tradicional, es más fácil optimizar el proceso y limpiarlo en el lugar, y tiene una vida útil más larga.

12. Purificación-Péptidos

Las fuentes de péptidos incluyen péptidos extraídos naturalmente, péptidos sintéticos y péptidos recombinantes. Los péptidos se degradan fácilmente mediante enzimas, pero pueden renaturalizarse a partir de disolventes o codisolventes orgánicos, por lo que se purifican mediante cromatografía de fase inversa altamente selectiva, como SOURCE 30RPC, SOURCE 15RPC, SOURCE 5RPC o miniperlas y monoperlas de intercambio iónico. Superdex Peptide HR es una columna preempaquetada de filtración en gel especialmente diseñada para la purificación de moléculas de péptidos. Puede usarse con cromatografía de fase reversa para crear mapas de péptidos más refinados. Las moléculas de péptidos se pueden preparar mediante intercambio iónico combinado con filtración en gel. Ciudad médica multifuncional

13. Purificación: ácido nucleico, virus

La purificación de ácido nucleico se utiliza para eliminar contaminantes que afectan la secuenciación o la PCR. Los ácidos nucleicos se pueden dividir aproximadamente en ADN plasmídico, ADN de fagos y productos de PCR. Los virus también pueden verse como macromoléculas de ácidos nucleicos. Al igual que el ADN plasmídico, podemos utilizar medios de filtración en gel Sephacry S-1000 SF, Superose o Sepharoce 4FF para eliminar impurezas y luego cooperar con el intercambio iónico de plasma Mono Q y SOURCE Q para separar los ácidos nucleicos.

14. Purificación: el oligonucleótido monofosfato se utiliza ampliamente en la síntesis de ADN antisentido, secuenciación de ARN, PCR y ADNc. Después de la síntesis, los subproductos de oligonucleótidos que contienen tritilo se pueden eliminar utilizando el intercambio aniónico Mono Q o una fuente rápida de baja contrapresión Q a pH 12 para evitar la aglutinación y la pérdida de grupos protectores. La capacidad de carga es mucho mayor que la de la cromatografía de fase inversa y puede usarse para preparaciones a gran escala. Las secuencias fallidas sin grupos tritilo se pueden eliminar mediante una columna ProRPC de fase reversa.

15. Desalado y eliminación de moléculas pequeñas

Utilizar medios filtrantes en gel Sephadex G10, G15, G25, G50, etc. Puede eliminar moléculas pequeñas con alta eficiencia y la capacidad de procesamiento puede alcanzar el 30% del volumen del lecho. Las moléculas pequeñas por debajo del límite superior del rango de separación del relleno se pueden eliminar fácilmente simplemente recogiendo el primer volumen de eluato de 1/3-1/2 de la columna después de la inyección. Como sólo se eliminan moléculas pequeñas, la altura de la columna es superior a 10 cm. Por lo general, todo el proceso se puede completar en unos minutos o media hora. La gama de medios Sephadex G25 está diseñada para la desalación de proteínas y la columna preempaquetada HiTrap Desalting (5 ml) está disponible mediante jeringa. HiPrep Desalting (26 ml) puede desalar hasta 10 ml de muestra en minutos.

16. Utilice el medio de filtración en gel Sepharose 4FF para la purificación de la vacuna y eliminar las proteínas impurezas del medio. La capacidad de procesamiento puede ser superior al 10% del volumen del lecho. La altura de la columna es generalmente de 40 a 70 cm y todo el proceso dura aproximadamente media hora. Las vacunas que actualmente se producen con este método incluyen las vacunas contra la hepatitis B, la rabia, la fiebre hemorrágica, la influenza, la tuberculosis, la polio, etc. Sephacryl S-500HR se puede utilizar en vacunas de pequeño peso molecular, como la vacuna contra la hepatitis A.

17. Análisis de polímeros antibióticos

Desde la edición del año 2000, la Farmacopea China exige que el porcentaje de polímeros en la ceftriaxona sódica se determine mediante el método de filtración en gel Sephadex G10.

18. Vectores virales purificados para terapia génica

SORRCE 15Q

19. Plásmidos purificados para terapia génica

Q Sepharose.

1. Eliminación de endotoxinas

Las endotoxinas también se llaman pirógenos. Al contener grasa A, azúcar y proteínas, es un polímero compuesto cargado negativamente.

La porción grasa de la endotoxina es altamente hidrofóbica. Sin embargo, se aglomerará en condiciones de alto contenido de sal y no se puede utilizar para cromatografía hidrófoba. El kit de prueba de cromatografía hidrófoba (17-1349-01) se puede utilizar para seleccionar medios que se unan a proteínas diana y eliminen endotoxinas.

La endotoxina está estrechamente unida al medio de intercambio aniónico q o DEAE Sepharose Fast Flow. Después de la elución, la proteína objetivo se puede eliminar con tampón con alto contenido de sal o NaOH.

CNBr o NHS Sepharose FF se pueden utilizar para acoplar sustratos de endotoxina como LAL y PMB para formar automáticamente un medio de cromatografía de afinidad que se une a la endotoxina. Las endotoxinas suelen ser polímeros que se eliminan eficazmente mediante cromatografía de filtración en gel.

2. Elimina los ácidos nucleicos de las proteínas.

Una gran cantidad de ácido nucleico aumenta la viscosidad de la muestra, expande el área, aumenta la contrapresión y reduce la resolución y el caudal. Las pruebas de drogas y de alimentos también tienen límites estrictos en cuanto al contenido de ácido nucleico.

El problema del ácido nucleico que expresa proteínas en las células es especialmente grave. Los ácidos nucleicos están cargados negativamente. Durante la purificación preliminar, se puede eliminar una gran cantidad de ácidos nucleicos utilizando medios de intercambio catiónico como Streamline, SP Sepharose Big Beads, SP o CM Sepharose FF, SP SepharoseXL, etc. para unirse a la proteína objetivo.

Los ácidos nucleicos se disociarán de las proteínas bajo un alto contenido de sal. Los medios de cromatografía hidrofóbica son muy adecuados para unir proteínas objetivo y eliminar ácidos nucleicos mientras se purifican las proteínas.

El ácido nucleico se corta en trozos pequeños mediante la nucleasa, que se puede eliminar fácilmente mediante filtración en gel para una purificación fina.

3. Eliminación - Virus y Microorganismos

Los virus y microorganismos pueden convertirse en patógenos y deben reducirse tanto como sea posible. Combinar diferentes técnicas cromatográficas, utilizar agua para inyección y desinfectar y limpiar periódicamente instrumentos y geles con NaOH puede evitar el aumento de contaminantes.

La mayoría de los virus tienen una capa lipídica. Los virus pueden ser inactivados por S/D (disolvente/detector) con carga opuesta a la proteína objetivo, como Triton y Tween. Luego, la proteína objetivo se puede combinar con un medio de intercambio iónico apropiado (como CM Sepharose FF) para eliminar S/D.

Se pueden alterar otros contaminantes cambiando el pH y la fuerza iónica para que interactúen con el desprendimiento o inactivación de la molécula diana. Los medios de filtración en gel Superdex y varios medios de adsorción SOURCE son buenos medios de purificación fina que pueden eliminar una variedad de trazas de contaminantes.

Gel se refiere a una mezcla de partículas con tamaños que van desde 1 angstrom hasta 10 angstroms. Para soluciones poliméricas y algunos soles, en condiciones apropiadas, todo el sistema se transformará en una sustancia viscosa semisólida elástica y perderá fluidez. Este fenómeno se llama gelificación y el producto formado se llama gel o jalea.

"Aerogel" se refiere a un sistema disperso que es gaseoso, como nubes y niebla, "gel sólido" incluye cristales parecidos al humo y "gel líquido" es un coloide líquido, como el coloide de hidróxido férrico. .

Ejemplo:

Goma de glucomanano de calidad alimentaria

La goma de glucomanano (también conocida como goma konjac) es una nueva goma comestible granular multiusos. El glucomanano introducido aquí se extrae de konjac de alta calidad y se procesa mediante tecnología avanzada para eliminar impurezas. Los ingredientes agregados no contienen ingredientes químicos ni pigmentos no comestibles. En comparación con los aditivos alimentarios tradicionales como el agar, la pectina y la goma de algas, la goma de glucomanano es significativamente mejor que las gomas anteriores en términos de tasa de expansión, viscosidad, espesamiento, estabilidad y facilidad de uso. Además, también tiene ventajas especiales: se puede congelar a temperatura ambiente sin agregar ningún coagulante en condiciones ácidas, neutras o alcalinas, y tiene propiedades de gel ideales que mantienen o fortalecen las propiedades hipoglucemiantes e hipoglucemiantes del glucomanano; los lípidos en sangre y la pérdida de peso han ampliado enormemente el ámbito de aplicación del konjac; es barato y fácil de usar.

La goma de glucomanano se puede utilizar ampliamente en alimentos, bebidas, medicinas, productos químicos diarios, investigaciones científicas y otros campos. Como sustituto del agar, pectina, gel de algas, etc. , precio bajo, puede reducir en gran medida el costo de los aditivos sin cambiar el equipo y los procesos originales. Es un nuevo aditivo de gel ideal. Para satisfacer las necesidades de desarrollo de diferentes productos, 1. Tipo gel (gelatina): se puede mezclar bien con diversos jugos, materiales y pigmentos naturales. Como excipiente en gel de amplio espectro, es una excelente materia prima para elaborar gelatinas, gomitas cristalinas, etc. , también se puede utilizar como soporte de medio de cultivo sin agregar ninguna otra goma o ingrediente alcalino, las condiciones de formación del gel son aleatorias, la copa se retira por completo y el gel tiene alta resistencia y dureza; Dosis: 0,7 ~ 0,9%. Instrucciones de uso: Hinchar en agua tibia adecuada durante 3 a 5 minutos, hervir y enfriar a unos 70 grados, agregar azúcar y varios ingredientes y luego enfriar a temperatura ambiente.

2. Tipo de medio: utilizado como soporte para el cultivo de flores y otros tejidos vegetales en lugar de agar. Las raíces de las plántulas cultivadas en tejidos son gruesas y las plántulas fuertes. El efecto de uso es ideal y el costo se reduce considerablemente. Dosis: 0,5 ~ 0,6%. Modo de empleo: Expandir en agua tibia durante 3~5 minutos, hervir y enfriar. 3. Tipo de bebida de pulpa (té): se utiliza como estabilizador y agente de suspensión, reemplazando el agar y la carboximetilcelulosa, etc. Se usa ampliamente en agentes de suspensión multifásicos como gránulos de naranja, té de frutas, jugos, leche de soja, hongos blancos, arroz con leche, etc. (o mezclar) para evitar la sedimentación o estratificación. Dosis: aproximadamente 0,15 ~ 0,25%. Instrucciones de uso: Después de hincharse completamente en agua tibia adecuada, agregar a los materiales. Tipo de producto congelado: se utiliza para productos congelados como paletas heladas y helados, que pueden aumentar la expansión, reducir los cristales de hielo, mejorar la resistencia al derretimiento por calor y hacer que el producto sea más refrescante. Dosis: aproximadamente 0,15 ~ 0,25%. Instrucciones de uso: Después de hincharse completamente en agua tibia adecuada, agregar a los materiales. 5. Tipo espesante: se utiliza en productos de mermelada, arroz y harina para aumentar la tasa de expansión, mejorar la dureza y mejorar la forma y el sabor. Es un sustituto ideal de la goma garrofín importada. Dosis: aproximadamente 0,2 ~ 0,3%. Instrucciones de uso: Después de hincharse completamente en agua tibia adecuada, agregar a los materiales.