¿Cuáles son las tecnologías de reproducción microbiana?

Los métodos suelen ser de dos tipos: selección natural y selección artificial, que pueden usarse solos o de forma cruzada.

Tecnología de mezcla de ADN

Editor

Con el desarrollo y la aplicación de la tecnología PCR, en 1994 Stemmer de Estados Unidos propuso una nueva tecnología de evolución molecular artificial—— Mezcla de ADN (también conocida como tecnología de mezcla), esta tecnología puede simular el proceso de evolución molecular de organismos durante cientos de años y puede detectar direccionalmente proteínas enzimáticas codificadas por genes específicos en un ciclo experimental corto, aumentando su actividad cientos de veces o incluso más Diez mil veces más genes mutantes funcionales. El principio básico es digerir un grupo de genes homólogos de diferentes fuentes pero con la misma función utilizando la ADN nucleasa I para generar pequeños fragmentos aleatorios. Estos pequeños fragmentos forman una biblioteca y sirven como cebadores y plantillas entre sí para la amplificación por PCR. El fragmento de copia del gen sirve como cebador para otra copia del gen, provoca el cambio de plantilla y se produce la recombinación. Después de introducirse en el cuerpo, el mutante positivo se selecciona para una nueva ronda de recombinación in vitro. Generalmente, tras 2 o 3 ciclos, se pueden obtener mutantes recombinantes con productos muy mejorados.

2 Selección natural

Editar

Aislamiento y purificación de microorganismos en la naturaleza sin mutagénesis artificial ni hibridación (ver Aislamiento y purificación de microorganismos), para luego realizar una selección pura. cultivo y determinación (ver método de determinación microbiológica), y seleccionar las mejores cepas de microorganismos. Este método es simple y fácil de implementar, pero la probabilidad de obtener cepas excelentes es pequeña y, en general, es difícil satisfacer las necesidades de producción.

3 Selección artificial

Editar

Se divide en dos tipos: cría por mutación y cría híbrida.

Cría por mutaciones

Tecnología de cría microbiana que utiliza mutaciones genéticas inducidas como medio. En 1927, H.J. Mahler descubrió que etc.) y factores mutagénicos químicos. Hay tres tipos de factores mutagénicos químicos: ① Un mutágeno cambia químicamente con una o más bases de ácido nucleico, provocando la sustitución de bases durante la replicación del ADN, como el ácido hidroxilamina nitroso, el sulfato de dietilo y el éster etílico, la nitroguanidina, la nitrosometilurea, etc. .; ② Los mutágenos son análogos estructurales de bases naturales que se incorporan a las moléculas de ADN durante la replicación para causar mutaciones, como 5-bromouracilo, 5-aminouracilo, 8-azaguanina y 2-aminopurina, etc.; ③ Los mutágenos reducen o aumentan 1 a; 2 bases en la molécula de ADN, lo que provoca errores en la transcripción y traducción de todos los códigos genéticos por debajo del punto de mutación de la base, lo que resulta en el código La aparición de mutantes de cambio de grupo, como las acridinas y algunos derivados de la mostaza nitrogenada (ICR), etc. El mejoramiento por mutación es fácil de operar, tiene una alta tasa de mutación y un amplio espectro de mutación. No solo puede aumentar el rendimiento y mejorar la calidad, sino también ampliar las variedades de productos y simplificar las condiciones del proceso. Por ejemplo, el título de las bacterias productoras de penicilina aisladas de la naturaleza en 1943 era de sólo 20 unidades/ml. Después de una serie de mutaciones, el título alcanzó 40.000 unidades/ml después de la mutagénesis de las bacterias productoras de clortetraciclina, el caldo de fermentación Demetilclortetraciclina; se ha acumulado en las bacterias después de la mutagénesis ultravioleta de Corynebacterium glutamicum 1299, algunas pueden producir lisina y otras pueden producir valina, lo que aumenta la variedad de productos que tienen las bacterias productoras de oxitetraciclina. Después de la mutagénesis, se seleccionó una cepa mutante que podría reducir la formación de espuma, por lo tanto; mejorando la utilización del fermentador. La desventaja de la reproducción por mutaciones es la falta de direccionalidad.

Cría de híbridos

Los híbridos se forman entre cepas o especies de diferentes genotipos mediante apareamiento o fusión de células somáticas, o se forman recombinantes mediante transformación y transducción, y luego a partir de estas se seleccionan cepas superiores. híbridos o recombinantes o su progenie. Mediante este método se pueden aislar recombinantes con nuevas combinaciones de genes y seleccionar nuevas cepas con crecimiento vigoroso, gran biomasa, fuerte adaptabilidad y mayor actividad de ciertas enzimas debido al vigor híbrido. Los métodos de cruzamiento varían dependiendo de los métodos reproductivos de las cepas experimentales, tales como hibridación sexual, recombinación cuasi sexual, fusión de protoplastos, transformación, transducción, transformación de plásmidos híbridos, etc., sin embargo, selección de cepas parentales, cultivo; descendencia de poblaciones aisladas, el proceso de seleccionar los mejores y eliminar los malos y el análisis genético híbrido son básicamente los mismos. El método de hibridación generalmente se refiere al apareamiento o fusión de cepas con reacciones de apareamiento para formar híbridos. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones y ha tenido éxito en el cultivo de levaduras de vino, pan, medicinales y alimentarias, en la mejora de la producción de antibióticos de Streptomyces y Penicillium y en la mejora de la actividad enzimática de Aspergillus.

La fusión de células somáticas es la fusión celular y la recombinación cromosómica entre cepas o especies que no son sexualmente reactivas. Primero se disuelve la pared celular con enzimas y luego se tratan los protoplastos con cloruro cálcico-polietilenglicol para promover la fusión. Consigue un híbrido. Este método juega un papel positivo en la mejora de cepas microbianas industriales.

La transformación y la transducción se aplicaron por primera vez a bacterias y ahora se utilizan ampliamente en Streptomyces y levaduras. Con el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, la construcción de plásmidos recombinantes y el establecimiento de sistemas de transformación, ahora es posible transferir genes diana a células receptoras y obtener cepas que puedan producir sustancias biológicamente activas de importante valor económico (como vacunas, enzimas , etc.) Empate.

Los microorganismos están muy relacionados con la industria cervecera, industria alimentaria, industria de productos biológicos, etc. La calidad de sus cepas está directamente relacionada con la calidad de diversos productos industriales, e incluso afecta a la calidad del consumo diario de las personas. vive, por lo que es necesario cultivar cepas microbianas de alta calidad y alto rendimiento.

El propósito del cultivo microbiano es guiar las vías metabólicas de la biosíntesis en la dirección que las personas desean, o promover la recombinación de genes en las células para optimizar los rasgos genéticos, la acumulación artificial excesiva de ciertos metabolitos y obtener el alto rendimiento y la alta calidad requeridos. y cepas de bajo consumo. Como uno de los enfoques, el mejoramiento por mutación se ha utilizado ampliamente. En la actualidad, la comunidad de cría de microbios nacionales utiliza principalmente factores físicos y químicos convencionales y otros métodos de mutagénesis. Además, la tecnología de mutagénesis de protoplastos se ha utilizado ampliamente en el cultivo de cepas bacterianas para preparaciones de enzimas, antibióticos, aminoácidos, vitaminas, etc., y ha logrado muchos resultados de gran importancia para las aplicaciones.

4 Crianza por mutación

Editar

1.1 Mutagénesis física

1.1.1 Irradiación ultravioleta

La irradiación ultravioleta es uno de los métodos de mutagénesis física más utilizados y es una herramienta muy útil para inducir mutaciones en microorganismos. El pico máximo de absorción de purina y pirimidina en el ADN y el ARN es de 260 nm, por lo que la radiación ultravioleta a 260 nm es el agente letal más eficaz. Hay muchas explicaciones para el efecto de la radiación ultravioleta, pero el efecto más seguro es que hace que las moléculas de ADN formen dímeros de pirimidina [1]. La formación de dímeros impedirá el emparejamiento normal entre bases, por lo que puede provocar mutaciones o incluso la muerte [2].

La mutagénesis por irradiación ultravioleta es sencilla de operar, económica y se puede lograr en condiciones generales de laboratorio, y la probabilidad de mutaciones positivas es alta. Este método se utiliza principalmente para la mutagénesis de cepas de levadura.

1.1.2 Radiaciones ionizantes

Los rayos γ son uno de los rayos ionizantes más utilizados en biología ionizante. Tienen alta energía y pueden producir ionización. Pueden usarse directamente o. Altera indirectamente la estructura del ADN. El efecto directo es oxidar la base de la desoxirribosa, o el enlace químico entre la desoxirribosa y el azúcar-fosfato. Su efecto indirecto es que puede hacer que el agua o las moléculas orgánicas generen radicales libres. Estos radicales libres pueden sufrir cambios químicos con las moléculas de soluto en las células, lo que lleva a la eliminación y daño de los componentes del ADN [2].

Además de los rayos γ, las radiaciones ionizantes también incluyen los rayos X, los rayos β y los neutrones rápidos. La radiación ionizante tiene ciertas limitaciones, altos requisitos operativos y ciertos riesgos. Generalmente se usa en procesos de reproducción de mutaciones donde no se pueden usar otros mutágenos.

1.1.3 Implantación de iones

La implantación de iones es una tecnología de alta tecnología que surgió a principios de los años 80 y se utiliza principalmente para modificar la superficie de materiales metálicos. Se ha utilizado gradualmente en el mejoramiento de cultivos desde 1986, y esta tecnología se ha introducido gradualmente en el mejoramiento microbiano en los últimos años [3].

Durante la implantación de iones, las biomoléculas absorben energía y provocan cambios físicos y químicos complejos. Los intermediarios de estos cambios son varios tipos de radicales libres activos. Estos radicales libres pueden causar daños a otras moléculas biológicas normales, provocar mutaciones cromosómicas en las células, roturas de cadenas de ADN y roturas de ADN plásmido. Dado que el rango de implantación de iones es controlable, con el desarrollo de la tecnología de microhaces y la tecnología de posicionamiento preciso, la mutagénesis de posicionamiento será posible [4].

El método de implantación de iones para la reproducción de mutaciones microbianas es difícil de lograr en condiciones generales de laboratorio y actualmente se utiliza relativamente raramente.

1.1.4 Láser

El láser es una especie de flujo cuántico de luz, también conocido como partículas de luz. La radiación láser puede afectar directa o indirectamente a los organismos mediante la aplicación combinada de efectos de luz, calor, presión y campos electromagnéticos, provocando efectos de distorsión de los cromosomas celulares, activación o inactivación de enzimas y cambios en la división celular y las actividades metabólicas de las células. Una vez que los cuantos de luz actúan sobre cualquier sustancia del contenido celular, pueden causar variaciones en las características celulares y genéticas de los organismos biológicos. Diferentes tipos de láser irradian organismos biológicos y presentan diferentes cambios citológicos y genéticos [5].

Como método de reproducción, el láser tiene las ventajas de un funcionamiento sencillo y un uso seguro. En los últimos años, el láser ha avanzado mucho en la reproducción microbiana.

1.1.5 Microondas

La radiación de microondas es un tipo de radiación electromagnética de baja energía. El rango de frecuencia con fuertes efectos biológicos es de 300 MHz a 300 GHz, y tiene características térmicas y no térmicas. efectos sobre los organismos vivos. Su efecto térmico significa que puede provocar un aumento de la temperatura local de los organismos. Por tanto, provocar reacciones fisiológicas y bioquímicas; los efectos no térmicos se refieren al hecho de que bajo la acción de las microondas, los organismos producirán diversas reacciones fisiológicas y bioquímicas que no están relacionadas con la temperatura. Bajo el efecto combinado de estos dos efectos, los organismos producirán una serie de efectos de mutación [6].

Por lo tanto, las microondas también se han utilizado en el mejoramiento por mutaciones en muchos campos, como el mejoramiento de cultivos, la cría de animales y el mejoramiento microbiano industrial, y han logrado ciertos resultados.

1.1.6 Mejora espacial

La reproducción espacial, también llamada reproducción por mutación espacial, es el uso de globos de gran altitud, satélites retornables, naves espaciales y otras naves espaciales para mutar semillas y tejidos de cultivos. , órganos o individuos vivos son transportados al espacio, utilizan el entorno especial del espacio para mutar genes biológicos y luego regresan a la tierra para realizar cría selectiva y nuevas técnicas de cultivo para desarrollar nuevas variedades y nuevos materiales. Los factores ambientales espaciales incluyen principalmente la microgravedad, la radiación espacial y otros factores mutagénicos, como campos magnéticos alternos, entornos de ultravacío, etc. La interacción de estos factores causa daño genético a los sistemas biológicos, lo que hace que los organismos sufran mutaciones, aberraciones cromosómicas y alteraciones celulares. inactivación, anomalías del desarrollo, etc.

La cría aeroespacial es especial que otros métodos de cría. Es una combinación orgánica de tecnología aeroespacial y tecnología de cría microbiana. Tiene un alto contenido técnico y un alto costo de lograr para los investigadores individuales o las unidades de investigación generales. Sólo se puede combinar con tecnología aeroespacial. La combinación la realiza el Estado.

1.1.7 Reproducción de mutaciones de plasma atmosférico y a temperatura ambiente

El plasma atmosférico y a temperatura ambiente (ARTP), denominado ARTP, se refiere a la capacidad de generar una temperatura de 25ºC bajo la atmósfera. Chorros de plasma entre -40 °C con una alta concentración de partículas activas (incluidos átomos de helio, átomos de oxígeno, átomos de nitrógeno, radicales OH, etc. en estados excitados). Como nuevo método físico, la tecnología ARTP tiene amplias perspectivas de aplicación en el campo de la reproducción por mutaciones microbianas.

Una dosis adecuada de partículas activas en el plasma actúa sobre los microorganismos, lo que puede cambiar la estructura y la permeabilidad de la pared/membrana celular microbiana y causar daño genético. Una vez que la cepa tiene daño en el material genético, el microorganismo se inicia. el mecanismo de reparación SOS , que induce la producción de ADN polimerasas IV y V, que no tienen la función correctora de la 3ˊ exonucleasa, por lo que incluso si aparecen bases desapareadas en el sitio dañado de la cadena de ADN, la replicación aún puede continuar. Permitir desajustes en esta situación aumenta las posibilidades de supervivencia. El daño causado por ARTP al material genético es muy diverso; y la reparación inducida por SOS en sí es una reparación tolerante a fallas. Por lo tanto, el daño causado por la diversidad de ARTP puede estar contenido en la cadena de ADN durante el proceso de reparación. replicación y reparación, sus posibles desajustes que pueden provocar diversidad.

ARTP se utiliza en la reproducción de mutaciones microbianas. Es de bajo costo y fácil de operar. No requiere equipos auxiliares como la aceleración de iones o electrones, el vacío y la refrigeración que requieren muchos equipos de mutagénesis física. inyección de haz de iones, etc.); ARTP es adecuado para El mecanismo de daño del material genético es diverso, con una alta tasa de mutación positiva y diversas propiedades de mutación. Es eficaz en hongos, bacterias, algas, etc. el medio ambiente y garantiza la seguridad personal del operador No importa qué tipo de gas se utilice para descargar, ninguno de ellos produce gases nocivos. [1]

5 Mutagénesis química

Editor

2.1.1 Agente alquilante

El agente alquilante puede interactuar con uno o más compuestos nucleicos La reacción ácido-base causa variación genética debido a la conversión del emparejamiento de bases durante la replicación del ADN. Los agentes alquilantes comúnmente utilizados incluyen metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina, etilenimina, sulfato de dietilo, etc.

El etilmetanosulfonato (EMS) es el agente alquilante más utilizado y tiene una alta tasa de mutagenicidad. La mayoría de las cepas mutantes inducidas por ella son mutaciones puntuales. La sustancia es altamente cancerígena y volátil, y el tiosulfato de sodio al 5% puede usarse como terminador y desintoxicante.

La N-Metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) es un supermutágeno muy utilizado, pero tiene cierta toxicidad, por lo que se debe tener cuidado durante su funcionamiento. En condiciones alcalinas, el NTG forma diazometano (CH2N2), que es una de las principales causas de letalidad y mutagénesis. Su efecto probablemente esté causado por la alquilación del ADN por CH2N2 [2].

El sulfato de dietilo (DMS) también se utiliza habitualmente, pero rara vez se utiliza debido a su fuerte toxicidad. La etilenimina, producida en cantidades más pequeñas, es difícil de comprar. La concentración de uso es del 0,0001% al 0,1%, lo que es altamente cancerígeno cuando se utiliza.

2.1.2 Análogos de bases

La estructura molecular de los análogos de bases es similar a las bases naturales y pueden incorporarse a las moléculas de ADN para provocar desajustes durante la replicación del ADN y transcripción desordenada y funcional del ARNm. recombinación de proteínas y cambios fenotípicos. Este tipo de sustancia es relativamente menos tóxica, pero tiene una alta tasa de mutagénesis negativa y, a menudo, es difícil obtener buenos mutantes. Incluye principalmente 5-fluorouracilo (5-FU), 5-bromouracilo (5-BU), 6-cloropurina, etc. Cheng Shiqing et al. [25] utilizaron 5-BU para mutagenizar células de bacterias productoras de pigmentos (Mycobacterium T17-2-39), y la biomasa aumentó en un promedio de 22,5%.

2.1.3 Compuestos inorgánicos

El efecto mutagénico es medio y el riesgo es bajo. El cloruro de litio de uso común es un cristal blanco. Cuando se usa, se puede mezclar en una solución al 0,1% ~ 0,5% o se puede agregar directamente al medio de cultivo sólido de mutagénesis y el tiempo de acción es de 30 minutos a 2 días. El ácido nitroso es fácil de descomponer, por lo que está listo para usar. Se prepara comúnmente a partir de nitrito de sodio y ácido clorhídrico. Prepare nitrito de sodio a una concentración de 0,01 ~ 0,1 mol/L. Cuando lo use, agregue ácido clorhídrico de igual concentración y volumen.

2.1.4 Otros

El clorhidrato de hidroxilamina, un agente reductor, actúa sobre el C para transformar G-C en A-T. También se utiliza habitualmente, con una concentración del 0,1% al 0,5% y un tiempo de acción de 60min a 2h.

Además, cuando se lleva a cabo la mutagénesis, se utilizan dos o más factores mutagénicos combinados, o se utiliza el mismo factor mutagénico repetidamente para conseguir mejores resultados. Gu Zhenghua et al. [7] utilizaron Corynebacterium glutamicum ATCC-13761 como cepa inicial y obtuvieron una cepa productora de L-histidina mediante múltiples tratamientos de mutagénesis con DMS y NTG.

2. Mutágenos

2.1 Selección de mutágenos

A la hora de seleccionar mutágenos, es necesario prestar atención a la especificidad de los mutágenos, es decir, una cierta El tratamiento mutágeno o mutagénico muta preferentemente ciertas partes del genoma mientras causa pocas mutaciones, si es que hay alguna, en otras partes. La base molecular de la especificidad del mutágeno no se comprende bien. Aunque las vías de reparación relevantes deben influir en esto, su relación no es tan simple. Otros factores, incluidas las condiciones ambientales del tratamiento de mutagénesis, también pueden influir en el tipo de mutación. .

Es difícil para los genetistas industriales predecir con precisión qué tipos de mutaciones a nivel molecular serán necesarias para mejorar una determinada cepa de bacterias. Por tanto, para generar tantos tipos de mutantes como sea posible, el enfoque más apropiado es emplear varios tipos complementarios de tratamientos de mutagénesis. Los rayos UV lejanos son sin duda el más adecuado de todos los mutágenos y parecen inducir todos los tipos de daños conocidos. También es fácil adoptar métodos de prevención eficaces y seguros. Entre los mutágenos químicos, los reactivos líquidos son más fáciles de manipular de forma segura que los reactivos en polvo. Otra desventaja es su tendencia a producir grupos de mutaciones estrechamente vinculadas, aunque este efecto puede ser una ventaja en algunos sistemas. Por último, hay que reconocer que determinadas cepas de bacterias pueden no ser mutagenizables con determinados mutágenos. Por supuesto, esto puede verificarse con bastante facilidad midiendo la cinética de mutagénesis de mutantes fácilmente detectables, como los mutantes resistentes a los medicamentos o los revertidos prototróficos. [8]

2.2 La dosis de mutágeno

Desde la perspectiva del mejor efecto del cribado aleatorio, la dosis óptima de mutágeno es obtener el valor más alto entre las poblaciones supervivientes utilizadas para selección de los mutantes deseados, ya que esto hará que la etapa de determinación del título sea menos laboriosa.

Por lo tanto, antes de mejorar la cepa, para determinar la dosis óptima de mutágenos que se utilizarán y sentar las bases para la tecnología de mejora mutagénica, suele ser inteligente medir los efectos de diferentes mutágenos en diferentes cepas bacterianas. Dinámica de mutaciones. A veces es imposible determinar la dosis óptima utilizando la mutación de alta unidad porque la detección de tales mutaciones es difícil. Sin embargo, si se utilizan marcadores fáciles de detectar, como los marcadores de resistencia a los medicamentos, aún se puede proporcionar información valiosa siempre que se estimen las limitaciones del método.