¿Cuáles son los pasos detallados para preparar péptidos antioxidantes de proteína de soja?
Aislado de proteína de soja proporcionado por Zhengzhou Tongchuang Yisheng Food Co., Ltd.; proteasa alcalina (2,4 AU/g), enzima compleja de sabor (500 LAPU/g), enzima compleja (1,5 AU) proporcionada por Novozyme/g); papaína (600.000 u/g) proporcionada por Guangxi Nanning Jiewo Biological Products Co., Ltd.; bromelina (2500 gdu) proporcionada por Guangzhou Toyota Chemical Co., Ltd.; pepsina (1:10000); (250 U.F.U/mg) y ácido linoleico (analíticamente puro), proporcionado por tampón fosfato Sigma (pH 9,35), solución de FeCl2-EDTA (0,05 mol/L), solución de FeCl2 (0,1 mol/L), KSCN (40). %), etanol (75 %, que contiene 0,3 mol/l de HCl), cromógeno de ninhidrina, solución de glicina (contenido de nitrógeno)
1.2 Instrumento
Espectrofotómetro UV-Visible, máquina de limpieza ultrasónica, centrífuga, medidor de acidez de pH, analizador de nitrógeno Kjeldahl, mezclador eléctrico reforzado, baño de agua eléctrico a temperatura constante, horno de secado a temperatura constante.
1.3 Método experimental
Determinación del contenido de nitrógeno en 1.3
Método de determinación de nitrógeno de Kjeldahl (GB/T5009.5-2003).
1.3.2 Preparación de la solución de péptido de soja
Preparar una solución de proteína de soja al 4% (p/v), calentar rápidamente a 80 °C y calentar en un baño de agua a 80 °C. durante 65438 ± 00 min. Luego se enfríe a la temperatura óptima de hidrólisis de la enzima, manteniendo la temperatura y la velocidad de agitación sin cambios, y use una solución estándar de NaOH (HCl) para ajustar el valor de pH de la solución al valor de pH óptimo para la hidrólisis enzimática. Pese la proteasa en proporción, agréguela a la solución de proteína de soja y comience a cronometrar. Durante la reacción, agregue una solución estándar de NaOH (HCl) a tiempo para mantener el pH constante, extraiga un cierto volumen de solución en el tiempo de reacción predeterminado y luego aumente rápidamente la temperatura a 85 °C para inactivar la enzima durante 65, 438 ± 00 minutos. Después de enfriar, centrifugar a 5000 rpm durante 65438±00 minutos y tomar el sobrenadante para medir el grado de hidrólisis y el valor antioxidante.
1.3.3 Determinación del grado de hidrólisis [4]
h = (A×10-3×10)/(14×0,1)= A/14(mmol/ml )
ho=4%×7,75=0,312 (mmol/ml)
DH(%)=h/ho=23A (1)
Nota: H: La concentración de -NH2 en la solución peptídica de soja (mmol/ml)
Ho: La concentración equivalente del enlace peptídico en la solución proteica (mmol/ml)
a : La solución de péptido de soja Concentración de nitrógeno (microgramos/ml)
1.3.4 Determinación de los parámetros de hidrólisis de proteasa
Los principales parámetros que afectan la tasa de hidrólisis de proteasa y el grado de hidrólisis de proteínas son temperatura, valor de pH, concentración de sustrato, concentración de enzima y tiempo. Utilizando el grado de hidrólisis como indicador, el valor óptimo de los parámetros se determina mediante un experimento de un solo factor y luego la combinación de factores se optimiza mediante un experimento ortogonal para determinar los parámetros de hidrólisis de la proteasa.
1.3.5 Determinación del valor antioxidante de los péptidos de soja [5]
Se utilizó la referencia [5] para determinar el valor antioxidante de los péptidos de soja, con las modificaciones apropiadas:
Coloque 100 ml de solución madre de ácido linoleico, 300 ml de solución FeCl2-EDTA de 0,05 mol/L y 500 ul de solución de péptido de soja en un matraz Erlenmeyer pequeño, mezcle uniformemente y guárdelo en la oscuridad a 50 °C durante 4 horas Luego saque 1000ul y agregue 200u10.1mol/L FeCl2. Agregue 1000 ul de solución de KSCN al 40 %, mezcle bien, saque 130 ul y colóquelos en un tubo de ensayo seco, agregue 6 ml de etanol (75 %, que contiene 0,3 mol/L de HCl), mezcle bien, reaccione durante 5 minutos y luego Mida la absorbancia de la solución mezclada a un valor de 481 nm. El valor de absorbancia de la solución de reacción de proteína de soja no hidrolizada se utilizó como valor en blanco y su valor antioxidante relativo fue 1.
Valor antioxidante relativo = valor de absorbancia de la solución de proteína no hidrolizada/valor de absorbancia de la solución de péptido de soja
2 Resultados experimentales
2.1 Curva estándar del contenido de nitrógeno
p>
Los valores de absorbancia de diferentes concentraciones de soluciones de trabajo de glicina medidos con un espectrofotómetro (580 nm) se muestran en la Figura 1.
La ecuación de regresión entre el contenido de nitrógeno y el valor de absorción es:
y=1,3342x+0,0133 (2),
El coeficiente de regresión es R2=0,998.
La función inversa de la ecuación (2) es x=0.425y-0.0095(3),
Coloque el valor de X en la ecuación (3) en la ecuación (1) El valor de a.
DH(%)=0,17y (4).
2.2 Determinación de los parámetros de hidrólisis de proteasas
Utilizando como indicador el grado de hidrólisis, mediante un único prueba de factores (debido a limitaciones de espacio, se omiten datos específicos) para determinar el rango de parámetros, pero la combinación de factores se optimiza mediante experimentos ortogonales. Las combinaciones óptimas de siete parámetros de proteasa se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 La mejor combinación de siete parámetros de hidrólisis de proteasa
Temperatura (℃) Valor de pH Concentración de sustrato (%) Concentración de enzima (%) Tiempo (minutos)
Enzima alcalina 60 8,0 3 0,5 60
Enzima del sabor 50 7,0 4 6 30
Enzima compleja 45 7,0 4 6 20
Papaína 55 7,5 5 3 40
Bromelana 65 8.0 5 6 30
Pepsina 37 2.5 4 2 30
Grado de hidrólisis de tripsina 50 7.0 5 3 302.3 Solución de péptido de soja
2.3.1 Valores de absorbancia de soluciones de péptidos de soja
Los valores de absorbancia de soluciones de péptidos de soja de diferentes concentraciones hidrolizadas por diferentes proteasas medidas con un espectrofotómetro (580 nm) se muestran en la Tabla 2. El valor de absorbancia de la solución de proteína hidrolizada es 0,178.
2.3.2 Grado de hidrólisis de la solución de péptido de soja
Sustituya el valor de absorbancia de la Tabla 2 en la ecuación (4) para obtener el grado correspondiente de hidrólisis de la solución de péptido de soja. se muestran en la Figura 2. Muestra que el grado de hidrólisis de la solución de proteína de soja que no ha sido hidrolizada por proteasa es del 3,03%.
Como se puede observar en la Figura 2, el grado de hidrólisis de la proteína de soja por las siete proteasas aumenta con la extensión del tiempo de hidrólisis (dentro de 4 horas), pero la tasa de hidrólisis comienza a aumentar y luego gradualmente disminuye. Entre ellas, la proteasa alcalina tiene una mayor capacidad de hidrólisis que las otras seis proteasas.
2.5 Valor antioxidante de la solución de péptido de soja
Después de la prueba antioxidante del tampón de ácido linoleico y la solución mixta de péptido de soja, utilice un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 481 nm y luego calcule el valor de la soja. El valor relativo de peróxido de la solución peptídica se utiliza para expresar la capacidad antioxidante de los péptidos de soja. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Tabla 2 Valores de absorción de soluciones de péptidos de soja en diferentes hidrolizados de proteasa
Valores de absorción de luz
1(1h)2(2h)3(3h) 4 (4h)
Enzima alcalina 0,605 0,705 0,975 0,985
Enzima aromatizante 0,545 0,632 0,877 0,909
Enzima compuesta 0,487 0,532 0,587 0,627
Proteasa de papaya 0,340 0,349 0,355 0,412
0,422 0,474 0,708 0,808
Gastricinasa 0,231,243 0,293 0,299
Panasa 0,583 0,599 0,603 3 media Se puede observar que el antioxidante La capacidad de la solución de péptido de soja hidrolizada con proteasa primero aumenta rápidamente con la prolongación del tiempo de hidrólisis enzimática (en 4 horas), luego aumenta lentamente y, en algunos casos, incluso se detiene. Entre estas siete enzimas, la solución de péptido de soja hidrolizada por proteasa alcalina tiene el mayor valor antioxidante.
3 Conclusión
(1) Los péptidos de soja tienen actividad antioxidante y las capacidades antioxidantes de los péptidos de soja preparados por diferentes proteasas también son diferentes.
(2) Entre las 7 proteasas estudiadas, la proteasa alcalina tiene la mayor capacidad para hidrolizar los péptidos de soja y tiene el mayor valor antioxidante, por lo que debería ser la mejor enzima. Referencia
[1] Chen HM, Muramoto K.Y, Tanuchi F, et al. Propiedades antioxidantes de los péptidos que contienen histidina derivados de fragmentos de péptidos que se encuentran en la digestión de proteínas de soja. alimento. Química, 1998, 46:49-53.
Zhang Xuezhong. Principios y aplicaciones de la tecnología de procesamiento de péptidos de soja. Beijing: Prensa de literatura científica y tecnológica, 1999: 181-200.
[3] Chen Meizhen. Estudio sobre la eliminación de radicales hidroxilo por el hidrolizado de proteína de soja. Ciencia de los alimentos, 2002, 23(1); 43-47.
[4] Él, Zhang Diqing. Química de alimentos saludables y tecnología de detección. Beijing: Prensa de la industria ligera de China.
[5]Adler-Nissen J. Hidrólisis enzimática de proteínas alimentarias. Editores de ciencias aplicadas de Elsevier. Nueva York, 1986:74-78.
*Soporte del proyecto: Proyecto clave de ciencia y tecnología de la provincia de Henan (0523011700).
Acerca del autor: Huang Ji (1971 ~), hombre, de Runan, Henan, Ph.D., investigador asociado, la dirección de la investigación es el procesamiento profundo de productos agrícolas y el desarrollo de alimentos funcionales.