Cómo construir un vector1 La selección y transformación de promotores son a menudo razones importantes por las que no se pueden obtener plantas transgénicas ideales. Debido a que los promotores desempeñan un papel clave en la determinación de la expresión genética, la primera consideración es seleccionar un promotor vegetal apropiado y aumentar su actividad. Actualmente, los promotores ampliamente utilizados en los vectores de expresión de plantas son promotores constitutivos. Por ejemplo, la mayoría de las plantas transgénicas dicotiledóneas utilizan el promotor C a M V 3 5 S, mientras que las plantas transgénicas monocotiledóneas utilizan principalmente el promotor U biquit in del maíz y el promotor Actin l del arroz. Bajo el control de estos promotores expresados constitutivamente, los genes extraños se expresarán en todas las partes de la planta transgénica y en todas las etapas de desarrollo. Sin embargo, la expresión continua de alta eficiencia de genes extraños en plantas receptoras no solo causa desperdicio, sino que a menudo también causa cambios morfológicos en las plantas y afecta su crecimiento y desarrollo. Para que los genes extraños desempeñen un papel eficaz en las plantas y reduzcan los efectos adversos en las plantas, la gente está prestando cada vez más atención a la investigación y aplicación de promotores de expresión específicos. Los promotores específicos descubiertos incluyen principalmente promotores específicos de órganos y promotores específicos de inducción. Por ejemplo, promotores específicos de semillas, promotores específicos de frutas, promotores específicos de células del mesófilo, promotores específicos de raíces, promotores inducidos por lesiones, promotores inducidos químicamente, promotores inducidos por luz, promotores inducidos por choque térmico, etc. La clonación y aplicación de estos promotores específicos sienta las bases para la expresión específica de genes extraños en plantas. Por ejemplo, la empresa suiza CBA-Geigey utiliza el promotor PR-IA para controlar la expresión de genes de la toxina Bt en tabaco transgénico. Dado que el promotor puede ser inducido por ácido salicílico y sus derivados, obviamente es un método muy eficaz para inducir la expresión de genes resistentes a insectos mediante la pulverización de productos químicos baratos y no contaminantes durante la temporada en la que reaparecen las plagas. En la investigación de plantas transgénicas, no se pueden obtener resultados satisfactorios utilizando promotores naturales. Especialmente cuando se realiza expresión específica y expresión inducida, los niveles de expresión son en su mayoría insatisfactorios. Transformar los promotores existentes y construir promotores compuestos será un enfoque muy importante. Por ejemplo, Ni et al. combinaron la región de activación de la transcripción del promotor del gen de la octopina sintasa con el promotor del gen de la manolina sintasa. Los resultados de la expresión de GUS mostraron que la actividad del promotor modificado era significativamente mayor que la del promotor 3 5 S. Wu Rui y otros combinaron el promotor inducible del gen PI-III con el intrón 1 del gen Actinl del arroz, y la actividad de expresión del nuevo promotor aumentó casi 10 veces (patente). Estos promotores artificiales desempeñan un papel importante en la investigación en ingeniería genética vegetal. 2. Mejorar la eficiencia de la traducción. Para mejorar la eficiencia de la traducción de genes extraños, los genes generalmente se modifican cuando se construyen vectores. Se consideran tres aspectos principales: 2.1 Agregar secuencias 5′-3′ no traducidas. Muchos experimentos han descubierto que la secuencia no traducida (UTR) 5′-3′ de genes eucariotas es muy necesaria para la expresión normal de genes. La eliminación de este segmento a menudo conduce a la estabilidad y el nivel de traducción del ARNm, como en el mosaico del tabaco. Hay un elemento ω que consta de nucleótidos de 68 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción del gen de la proteína de 126 kDa del virus (TMV). Proporciona un nuevo sitio de unión para el ribosoma, que puede unirse a la actividad de traducción de nosotros. .Los genes aumentan decenas de veces. Actualmente, muchos vectores añaden secuencias potenciadoras de la traducción ω al extremo 5' de genes exógenos. Ingelbrecht et al. estudiaron las secuencias del extremo 3' de varios genes y descubrieron que la secuencia del extremo 3' del gen de la octopina sintasa puede aumentar la expresión transitoria del gen NPTI III en más de 20 veces. Además, las secuencias del extremo 3' de diferentes genes tienen diferentes eficiencias para promover la expresión génica. Por ejemplo, la secuencia terminal 3' de los glóbulos rojos promueve la expresión génica 60 veces más que el gen de la chalcona sintasa. 2.2 Optimizar la secuencia alrededor del codón de inicio Aunque el codón de inicio es universal en biología, los genes de diferentes fuentes biológicas tienen sus propias secuencias especiales alrededor del codón de inicio. Por ejemplo, las características típicas de la secuencia alrededor del codón de inicio de la planta es A A C C A U G C, y la secuencia alrededor del codón de inicio del animal es C A C C A U G, que es muy diferente de la de los procariotas. K o z a k estudió en detalle el efecto de la mutación dirigida al sitio de las bases alrededor del codón de inicio A T G sobre la transcripción y la traducción, y concluyó que en eucariotas, cuando la secuencia alrededor del codón de inicio es C C A T G G, la eficiencia de transcripción y traducción es la más alta, especialmente Las posiciones at-3 son muy importantes para la eficiencia de la traducción. Esta secuencia se conoció más tarde como secuencia k0z a K y se utilizó en la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, existe un gen de quitinasa bacteriana cuya secuencia de código inicial original es U U U A U G G. Cuando se modificó a A C C A U G G, su nivel de expresión en el tabaco se multiplicó por ocho. Por lo tanto, cuando se construye un vector de expresión utilizando genes no vegetales, se debe modificar de acuerdo con las características de la secuencia que rodea el codón de inicio de la planta. 2.3 Modificación de regiones codificantes de genes Si los genes extraños provienen de procariotas, los niveles de expresión de estos genes en las plantas suelen ser muy bajos debido a diferencias en los mecanismos de expresión.
Por ejemplo, el gen de la proteína insecticida de tipo salvaje del Bacillus thuringiensis tiene un nivel de expresión muy bajo en las plantas. Se descubrió que esto se debe a la diferencia entre los genes de los procariotas y de las plantas, lo que conduce a una disminución de la estabilidad del ARNm sin cambios. la secuencia de aminoácidos de la proteína venenosa Bajo esta premisa, Perlak y otros de la compañía Monsanto en Estados Unidos modificaron el gen de la proteína insecticida, seleccionaron codones preferidos por las plantas, aumentaron el contenido de GC y eliminaron elementos de la secuencia original que afectaban la proteína venenosa. estabilidad del ARNm. Como resultado, el nivel de expresión de la proteína venenosa en las plantas transgénicas aumentó de 30 a 100 veces, logrando evidentes efectos antiinsectos. 3 Eliminar los efectos de posición Cuando se transfieren genes extraños a plantas receptoras, sus niveles de expresión en diferentes plantas transgénicas a menudo varían mucho. Esto se debe principalmente a los diferentes sitios de inserción de genes extraños en el genoma de las plantas receptoras. Éste es el llamado "efecto de posición". Para eliminar los efectos de posición e integrar todos los genes extraños en la región transcripcionalmente activa del genoma de la planta, las estrategias actuales de construcción de vectores de expresión generalmente consideran la aplicación de regiones de unión a la matriz nuclear y tecnología de integración dirigida al sitio. M A T R I X A S O C I A C I O N R E G I O N (M A R) es una secuencia de ADN que existe en la cromatina de las células eucariotas y se une específicamente a la matriz nuclear. En general, se cree que la secuencia de MAR se encuentra en el límite de la estructura circular del ADN transcrito activamente y su función es causar la división, de modo que cada unidad de transcripción permanece relativamente independiente y no se ve afectada por la cromatina circundante. Estudios relevantes han demostrado que colocar M A R en ambos lados del gen objetivo y construir un vector de expresión vegetal que contenga la estructura M A R-g e n e-M A R para la transformación genética puede mejorar significativamente el nivel de expresión del gen objetivo y reducir la diferencia en el nivel de expresión de El gen objetivo entre diferentes plantas transgénicas, reduce el efecto de posición. Por ejemplo, Allen et al. estudiaron los efectos de MAR heterólogo (de levadura) y MAR homólogo (de tabaco) sobre la expresión del gen Gus en el tabaco y encontraron que el MAR de levadura puede aumentar el nivel de expresión del transgén en un promedio de 65438 ± 0,2. veces, mientras que el propio MAR del tabaco puede aumentar los niveles de expresión transgénica en una media de 60 veces. También se puede lograr el mismo efecto utilizando MAR derivado del gen de la lisozima de pollo. Otro enfoque posible es utilizar tecnología de integración orientada al sitio. El principio fundamental de esta tecnología es que cuando el vector de transformación contiene un fragmento de ADN homólogo al cromosoma del huésped, el gen extraño puede integrarse en una parte específica del cromosoma mediante recombinación homóloga. En la práctica, primero se debe aislar el fragmento de ADN de la región transcripcionalmente activa del cromosoma y luego se puede construir el vector de expresión vegetal. En la manipulación genética de microorganismos, la integración dirigida al sitio de la recombinación homóloga se ha convertido en una tecnología de rutina. La integración dirigida al sitio de genes extraños ha tenido éxito en animales. Sin embargo, en plantas, a excepción de los vectores de expresión de cloroplastos, hay pocos informes de éxito. Transformación nuclear. 4 Construcción del vector de expresión de cloroplasto Para superar los problemas de baja eficiencia de expresión, efecto de posición e inseguridad causados por la difusión de genes nucleares con polen durante la transformación nuclear, una nueva tecnología de transformación genética que ha surgido en los últimos años: la transformación de cloroplasto tiene su Ventajas y desarrollo La perspectiva es cada vez más reconocida y valorada por la gente. Hasta ahora, se ha logrado la transformación de cloroplastos en cinco plantas: tabaco, arroz, Arabidopsis, patata y colza (publicado por Hou Bingkai et al.), lo que convierte a esta tecnología de transformación en un nuevo punto de crecimiento en la ingeniería genética vegetal. Actualmente se han determinado las secuencias completas de muchos genomas de cloroplastos de plantas, lo que sienta las bases para la integración específica de un sitio de genes extraños en el genoma de los cloroplastos mediante el mecanismo de recombinación homóloga. Los vectores de expresión de cloroplastos construidos hasta ahora son básicamente vectores de integración dirigidos al sitio. El vector de expresión de cloroplasto construido es básicamente un vector de caso de sitio fijo. Al construir un vector de expresión de cloroplasto, normalmente se conecta una secuencia de ADN del cloroplasto a ambos lados del casete de expresión del gen exógeno, lo que se denomina fragmento de recombinación homóloga o fragmento de posicionamiento (fragmento de destino). Cuando el vector se introduce en el cloroplasto, mediante recombinación homóloga entre estos dos fragmentos y el mismo fragmento en el genoma del cloroplasto, es posible integrar el gen extraño en un sitio específico del genoma del cloroplasto. En la transformación de cloroplastos para el mejoramiento de cultivos, se requiere que después de la recombinación homóloga, la inserción de genes extraños no cause la pérdida de la secuencia original del gen del cloroplasto, ni destruya la función del gen original en el punto de inserción. Para cumplir con este requisito, se seleccionaron dos genes adyacentes como fragmentos de recombinación homóloga, como r b c L/a c c D, 1 6S TR NV/R PS L 2R PS 7, PB BA/T R NK, RP S 7/N D HB. Cuando ocurre la recombinación homóloga, el gen extraño se inserta en la región espaciadora de dos genes adyacentes en una ubicación específica, asegurando que la función del gen original no se vea afectada. Recientemente, D'ANIEL et al. utilizaron los genes del cloroplasto del tabaco t rn A y t rn I como fragmentos de recombinación homóloga para construir un V E C T O R UNIVERSAL (U NIVE R S A L V E C T O R). Dado que las secuencias de ADN de trnA y trnI están altamente conservadas en las plantas superiores, los autores creen que este vector puede usarse para la transformación de cloroplastos en muchas plantas diferentes.