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上篇: Cómo construir un vector1 La selección y transformación de promotores son a menudo razones importantes por las que no se pueden obtener plantas transgénicas ideales. Debido a que los promotores desempeñan un papel clave en la determinación de la expresión genética, la primera consideración es seleccionar un promotor vegetal apropiado y aumentar su actividad. Actualmente, los promotores ampliamente utilizados en los vectores de expresión de plantas son promotores constitutivos. Por ejemplo, la mayoría de las plantas transgénicas dicotiledóneas utilizan el promotor C a M V 3 5 S, mientras que las plantas transgénicas monocotiledóneas utilizan principalmente el promotor U biquit in del maíz y el promotor Actin l del arroz. Bajo el control de estos promotores expresados constitutivamente, los genes extraños se expresarán en todas las partes de la planta transgénica y en todas las etapas de desarrollo. Sin embargo, la expresión continua de alta eficiencia de genes extraños en plantas receptoras no solo causa desperdicio, sino que a menudo también causa cambios morfológicos en las plantas y afecta su crecimiento y desarrollo. Para que los genes extraños desempeñen un papel eficaz en las plantas y reduzcan los efectos adversos en las plantas, la gente está prestando cada vez más atención a la investigación y aplicación de promotores de expresión específicos. Los promotores específicos descubiertos incluyen principalmente promotores específicos de órganos y promotores específicos de inducción. Por ejemplo, promotores específicos de semillas, promotores específicos de frutas, promotores específicos de células del mesófilo, promotores específicos de raíces, promotores inducidos por lesiones, promotores inducidos químicamente, promotores inducidos por luz, promotores inducidos por choque térmico, etc. La clonación y aplicación de estos promotores específicos sienta las bases para la expresión específica de genes extraños en plantas. Por ejemplo, la empresa suiza CBA-Geigey utiliza el promotor PR-IA para controlar la expresión de genes de la toxina Bt en tabaco transgénico. Dado que el promotor puede ser inducido por ácido salicílico y sus derivados, obviamente es un método muy eficaz para inducir la expresión de genes resistentes a insectos mediante la pulverización de productos químicos baratos y no contaminantes durante la temporada en la que reaparecen las plagas. En la investigación de plantas transgénicas, no se pueden obtener resultados satisfactorios utilizando promotores naturales. Especialmente cuando se realiza expresión específica y expresión inducida, los niveles de expresión son en su mayoría insatisfactorios. Transformar los promotores existentes y construir promotores compuestos será un enfoque muy importante. Por ejemplo, Ni et al. combinaron la región de activación de la transcripción del promotor del gen de la octopina sintasa con el promotor del gen de la manolina sintasa. Los resultados de la expresión de GUS mostraron que la actividad del promotor modificado era significativamente mayor que la del promotor 3 5 S. Wu Rui y otros combinaron el promotor inducible del gen PI-III con el intrón 1 del gen Actinl del arroz, y la actividad de expresión del nuevo promotor aumentó casi 10 veces (patente). Estos promotores artificiales desempeñan un papel importante en la investigación en ingeniería genética vegetal. 2. Mejorar la eficiencia de la traducción. Para mejorar la eficiencia de la traducción de genes extraños, los genes generalmente se modifican cuando se construyen vectores. Se consideran tres aspectos principales: 2.1 Agregar secuencias 5′-3′ no traducidas. Muchos experimentos han descubierto que la secuencia no traducida (UTR) 5′-3′ de genes eucariotas es muy necesaria para la expresión normal de genes. La eliminación de este segmento a menudo conduce a la estabilidad y el nivel de traducción del ARNm, como en el mosaico del tabaco. Hay un elemento ω que consta de nucleótidos de 68 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción del gen de la proteína de 126 kDa del virus (TMV). Proporciona un nuevo sitio de unión para el ribosoma, que puede unirse a la actividad de traducción de nosotros. .Los genes aumentan decenas de veces. Actualmente, muchos vectores añaden secuencias potenciadoras de la traducción ω al extremo 5' de genes exógenos. Ingelbrecht et al. estudiaron las secuencias del extremo 3' de varios genes y descubrieron que la secuencia del extremo 3' del gen de la octopina sintasa puede aumentar la expresión transitoria del gen NPTI III en más de 20 veces. Además, las secuencias del extremo 3' de diferentes genes tienen diferentes eficiencias para promover la expresión génica. Por ejemplo, la secuencia terminal 3' de los glóbulos rojos promueve la expresión génica 60 veces más que el gen de la chalcona sintasa. 2.2 Optimizar la secuencia alrededor del codón de inicio Aunque el codón de inicio es universal en biología, los genes de diferentes fuentes biológicas tienen sus propias secuencias especiales alrededor del codón de inicio. Por ejemplo, las características típicas de la secuencia alrededor del codón de inicio de la planta es A A C C A U G C, y la secuencia alrededor del codón de inicio del animal es C A C C A U G, que es muy diferente de la de los procariotas. K o z a k estudió en detalle el efecto de la mutación dirigida al sitio de las bases alrededor del codón de inicio A T G sobre la transcripción y la traducción, y concluyó que en eucariotas, cuando la secuencia alrededor del codón de inicio es C C A T G G, la eficiencia de transcripción y traducción es la más alta, especialmente Las posiciones at-3 son muy importantes para la eficiencia de la traducción. Esta secuencia se conoció más tarde como secuencia k0z a K y se utilizó en la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, existe un gen de quitinasa bacteriana cuya secuencia de código inicial original es U U U A U G G. Cuando se modificó a A C C A U G G, su nivel de expresión en el tabaco se multiplicó por ocho. Por lo tanto, cuando se construye un vector de expresión utilizando genes no vegetales, se debe modificar de acuerdo con las características de la secuencia que rodea el codón de inicio de la planta. 2.3 Modificación de regiones codificantes de genes Si los genes extraños provienen de procariotas, los niveles de expresión de estos genes en las plantas suelen ser muy bajos debido a diferencias en los mecanismos de expresión. 下篇: ¿Cuáles son las consecuencias de las inspecciones aleatorias por parte de auditorías industriales y comerciales?